结核分枝杆菌双组分调控发系统kdpde基因缺失株的构建及功能的初步研究.docx

学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 葛 如需保密，解密时间 年 月 日 II 独创性声明YIII 13U10IIl5112I 118I 14III 1I 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中做了明确的说明。并表示了谢意。 研究生签名： 本花 时间：2。J6 年6月f8 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校 要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并 提供目录检索和阅览服务。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分 内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在 其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用予本授权书。 学位论文作者签名：寿屯 导师签名：谭臣 签名日期：2Df 6年6月18日 签名日期：三Df6年6月?8日 万方数据 结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD／E基因缺失株的构建及功能的初步研究目 结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD／E基因缺失株的构建及功能的初步研究 目 录 摘墨要 ．i Abstract ． ．． ． ． ． ．． ． ．．．．． ． ． ． ． ． ． ．．．ii 缩略语表(Abbreviation) iv 1文献综述 一l 1．1结核分枝杆菌概述 l 1．1．1结核分枝杆菌病原学 ．1 1．1．2结核分枝杆菌流行病学 ．2 1．2结核分枝杆菌双组分调控系统 3 1．2．1结核分枝杆菌双组分调控系统概述 ．3 1．2．2结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD／E研究进展 一5 2研究目的与意义 ．8 3材料与方法 ．9 3．1实验材料 9 3．1．1菌株、质粒载体和细胞 ．9 3．1．2主要试剂及试剂盒 ．9 3．1．3培养基及抗生素的配制 10 3．1．4主要溶液的配制 11 3．1．5引物 一14 3．2实验方法 ．16 3．2．1结核分枝杆菌基因组DNA的提取 ．16 3．2．2同源重组载体的构建 16 3．2．3高滴度噬菌体裂解液的制备 20 3．2．4噬菌体感染待敲除菌株以及基因缺失株的鉴定 21 3．2．5基因缺失株生长特性的研究 22 3．2．6 THP．1细胞入侵实验和胞内存活实验 23 3．2．7 KdpE蛋白的原核表达及纯化 ．24 3．2．8兔抗KdpE蛋白多克隆抗体的制备 27 3．2．9结核分枝杆菌总RNA的提取 ．27 3．2．10荧光定量PCR ．28 4结果与分析 30 4．1同源重组载体的构建 ．30 4．1．1 pYUBl471重组质粒的构建 30 4．1．2 phAEl59重组质粒的构建 3l 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文4．2基因缺失株的鉴定 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 4．2基因缺失株的鉴定 一33 4-3基因缺失株生长特性的研究 35 4．3．1生长曲线的绘制 35 4．3．2菌落形态的比较 36 4．4 THP．1细胞入侵实验和胞内存活实验 ．．36 4．5 KdpE蛋白的原核表达及纯化 37 4．5．1 pET-28a-kdpE重组质粒的构建 37 4．5．2 KdpE蛋白的诱导表达及纯化 ．．38 4．6兔抗KdpE蛋白多克隆抗体的制备 39 4．7结核分枝杆菌总RNA的提取 40 4．8荧光定量PCR检测差异表达基因 4l 5讨论 ． ． ． ． ． ． ． ． ．． ．． ． ．． ． ．—}3 5．1结核分枝杆菌基因缺失方法的探讨 一43 5．2 KdpD／E的缺失对结核分枝杆菌生长特性的影响 43 5．3 KdpD／E的缺失对结核分枝杆菌在感染巨噬细胞过程中的影响 44 5．4反应调节蛋白KdpE的表达和多克隆抗体的制备 44 5．5 KdpD／E的缺失对结核分枝杆菌重要功能基因的影响 45 6结论 一46 参考文献 47 致谢 ～56 万方数据 结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD／E基因缺失株的构建及功能的初步研究摘要 结核分枝杆菌双组分调控系统KdpD／E基因缺失株的构建及功能的初步研究 摘要 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是导致人类结核病(