氨基酸门纸层析.pptVIP

* * 实 验 一氨基酸纸层析 * * 1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层 析的原理和操作技术； 2、掌握分配层析法； 3、掌握影响分配系数的因素。 一、实验目的： * * 层析技术(chromatography 色谱技术) 一、发展史： 层析分离技术在20世纪初就已得到应用： 1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法” 1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体； 1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析； 20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。 * * 二、定义 层析技术是根据被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中进行分配。 层析的基本概念 * * 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 层析的基本概念 * * 三、层析技术的种类 1、按流动相的状态分类： （1）液相层析（色谱） （2）气相层析（色谱）； 2、按固定相的使用形式分类： （1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析； 3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类： （1）吸附层析 （2）分配层析 （3）离子交换层析 （4）凝胶层析 （5）亲和层析等。 * * 纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。 滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。 将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点 二、实验原理: * * 分配层析法： 利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数α是一个常数。 溶质在固定相的浓度(Cs) 分配系数α= 溶质在流动相的浓度（Cl) * * 溶剂系统： 正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相; 流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。 由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。 * * 移动速率(比移值)： 原点到层析点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离 * * 影响Rf值的主要因素： Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及 两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体 积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物 质分配系数不同，Rf也就不同。 （1）物质的结构和分子极性： 物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也 就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间 的分配系数，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf 小；反之,Rf则较大。 * * （2）层析溶剂： 首先，溶剂的纯度要高。 其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.05～0.85。 再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇- 甲酸-水系统久放易引起酯化。 （3）pH值： 溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变； * * （4）滤纸： 层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同； 另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.01～0.4M的HCl处理除去金属离子）. * * （5）室验室的温度和时间: 温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数； 也影响滤纸