解淀粉芽胞杆菌bacillus amyloli点quefaciens t27甘露聚糖酶的发酵及酶学性质研究.docxVIP

华中农业大学201 华中农业大学201 l届硕士研究生学位论文 摘 要 肛甘露聚糖酶(p．1，4-D．mannan mannohydrolasc，E．C 3．2．1．78)特异性地水 解甘露聚糖类半纤维素，产生大量的甘露寡糖和少量的甘露糖。该酶广泛的存在于 植物，动物，微生物中，应用于食品工业、造纸工业、纺织工业和饲料工业中。由 于工业生产要求所使用的酶具有较强的稳定性、耐热性，乃至耐酸碱等特性，人们 将目光投向高压、高温和特殊pH等极端环境的微生物，以寻求新型酶资源。从海 洋微生物中筛选特殊性质的p甘露聚糖酶的菌株，是开发甘露聚糖酶的一个新方 向。 本研究从海泥中筛选出一株高活性甘露聚糖酶产生菌，16sDNA序列分析表 明。该序列与解淀粉芽胞杆菌的16srDNA序列同源性为100％，将该菌株命名为 Bacillus amyloliquefaciens T27。对该菌株产酶条件进行了优化，发现以魔芋粉为碳 源，酵母粉为氮源，装液量为50ml，摇速为250rpm，在37C，培养24小时的条 件下，显示出最佳产酶活性，发酵液中粗酶活达到98U／ml。为了进一步研究该菌 株甘露聚糖酶的酶学性质，根据芽胞杆菌甘露聚糖酶基因序列设计引物，扩增获得 了Bacillus amyloliquefaciens T27的甘露聚糖酶基因。测序结果表明，该基因全长 los3bp， 编码360个氨基酸，将其命名为Man27T。同源分析结果显示，该基因 与芽胞杆菌的甘露聚糖酶同源性最高，属糖苷水解酶家族26。 将该酶基因Man27T插入大肠杆菌表达载体pGEX-6p-I上，转化大肠杆菌 E．coli(BL21)DE3进行表达，并对重组酶的酶学性质进行了分析r重组酶在pH- 7．0，40(2条件显示出最高活性， 80℃条件下活性仍保持60％以上．在pH4．0-10．0 条件下，处理1h活性基本不改变，表明该酶有较宽的pH稳定性。这些特性奠定 了进一步研发应用该酶的基础。 关键词：解淀粉芽孢杆菌甘露聚糖甘露聚糖酶克隆高活性高温活性 解淀粉芽胞杆菌Bacillus 解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens力7甘露聚糖酶的发酵及酶学性质研究 Abstract 肛ma．nanase hydrolyzes mannan specially， ．berating maunan-olignsaccharides and mannosc． It widemy spreads among plants， animal and microorganism，which shows extensive purpose in the food industry,paper industry， fabric industry and feed additive industry． As industrial process often demand the enzyme to be of high stability，thermostablity， and even alkaline or acid stabmty， researchers have focused on the extreme environments，such蹈high-pressure，hi，gh temperature, and extreme pH environments，to find extremophiles which may produce enzyme、)l，itll special properties．Screening of maline microorganisms with p咱蚴珊擒撒producing ability from the special nature is a new trend to mine novel mannanasc． In this researcht one me swain that shows remarlmblely=．degrading a：bilty is screened from∞a mud．1 6srDNA sequence of this strain is determined to be of 100％identity to species Bacillus amyloliq『uefaciens，and thus the strin is designated Bacillus amyloliquefaciens他7．Optimization of enzyme production using different parameters found that usmg konjac flour as