第3章基因工吧程制药.ppt

20 mmol/ LTris-HCl，pH8.0缓冲液平衡阳离子交换拄 上样，NaCl梯度洗脱 收集目标峰 加固体硫酸铵至2mol/ L 上样疏水凝胶柱 2~0mol/ L的硫酸铵梯度洗脱 5mmol/ L磷酸平衡G25 上样脱盐 冷冻干燥 第十节 基因工程药物介绍 一、重组胰岛素 胰岛素的作用是降低血糖浓度，达到治疗糖尿病的目的 胰岛素是制剂 ,不良反应 ,猪胰岛素 1982年开始，美国等批准用DNA重组技术生产的人源化胰岛素 三种生物合成胰岛素的方法 (a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有10～20％ (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80％以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。 (c) AB链同时表达法 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。 根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。 二、重组干扰素α 上个世纪50年代末期临床应用，从血液中直接提取 70年代，干扰素可以直接从供血的白细胞中直接提取 目前一般采用大肠杆菌表达系统生产。发酵纯化，再结晶，分离后的产品溶解在甘氨酸和人白蛋白作为赋形剂的磷酸盐缓冲液中冻干 干扰素α可以明显地抑制胸腺癌、某些淋巴肿瘤和多发性骨髓瘤，还能抑制骨髓型肉瘤手术后肿瘤的复发 三、重组水蛭素 1884年，John Haycraft发现了医用水蛭的提取物中含有抗凝血的物质 1957年，德国的Fritz Markwardt 从医用水蛭的唾液腺中分离纯化出这种抗凝血的物质，并命名为水蛭素 水蛭素现在已经能用大肠杆菌和酵母进行生产 水蛭素在抗凝血酶治疗方面有以下的优势：直接作用于凝血酶；不需要辅助因子；比许多其他抗凝剂导致偶然出血的可能性小；是一个弱的免疫原 细胞的代谢负荷 大量复制质粒和表达外源基因，会破坏宿主菌原有的代谢平衡 减轻细胞代谢负荷的一个方法是菌体的生长和表达外源基因分为两个阶段 发酵条件的优化 二、酵母表达系统 1. 外源基因的拷贝数 相对于大肠杆菌，酵母的质粒要少得多，而整合型的质粒，如毕赤酵母，由于拷贝数可以比较高，所以现在用地非常普遍 2. 外源基因的表达效率 1）启动子 2）分泌信号的效率 3）终止序列的影响 4）偏好密码子的使用 3. 外源蛋白的糖基化 4. 宿主菌的选择 1）生长力强 2）内源蛋白酶活性弱 3）菌株性能稳定 4）分泌能力强 5. 发酵条件的优化 第八节 重组蛋白的复性策略 包含体（包涵体） ：又称光折射体，大肠杆菌高量表达外源基因时，大量的表达产物和DNA碎片、RNA、核糖体等结合在一起形成的一种颗粒 包含体中的蛋白质一般是不正确折叠的蛋白，特别是二硫键的错配 高效表达的目的蛋白 在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。 因无法有效的解决复 性问题，在美国每年 造成的经济损失就达 几十亿美元 包含体电镜图 一、减少包含体的策略 温度 分泌表达 选用合适的宿主菌和载体 稀有密码子 二、包含体的复性 包含体是不溶性物质，其中的蛋白质复性一般过程是：用盐酸胍、去污剂（Triton）等处理，是蛋白变成完全随机的结构形式，然后除去变性剂，再重新折叠成结构活性的蛋白 包含体复性方法 溶液中复性 反胶束环境复性 分子伴侣 固相复性 二硫键形成的方法 空气氧化 巯基化合物 二硫键异构酶 混合二硫键交换法 第九节 分离纯化实例 1. 重组类人胶原蛋白 胶原是结缔组织的结构蛋白 胶原蛋白是在提取胶原时，结构没有改变的一类蛋白 羟脯氨酸 重组类人胶原蛋白是通过逆转录在人体中钓取基因后，进行了某些位点的突变，并在大肠杆菌中表达的重组蛋白 分子量70，000 方法：亲和层析纯化  发酵后的工程菌，5000r/min离心30分钟 质液比1：6将菌体悬浮于细胞破碎缓冲液中（1mmol/LEDTA,5mmol/LTris） 冰水浴中超声波破碎仪间断超声十次，每次90秒 破碎液于4℃，5000r/min离心1小时，收集上清液 上清液用硫酸铵分级沉淀 收集15%~65%饱和度的蛋白质沉淀 沉淀溶解在缓冲溶液中（20 mmol/ LTris-HCl，pH8.0） 截流分子量30，000的超滤膜脱盐浓缩 脱盐的样品和平衡缓冲液（1mmol/LNaCl）1：1混合 层析柱用锌离子充分螯合，