荧光定量PCR技术讲座.ppt

四、反应体系的优化 2、如何优化 优化后的Taqman探针体系实验结果，Mg2＋浓度为5.0mM左右，引物浓度为500nM，探针浓度为250nM。 四、反应体系的优化 3、自行配制荧光定量PCR试剂 （1）、常用的SYBR GreenⅠ预混酶（2X） HotStar TaqE ＋ Buffer ＋ Mg2 其中Mg2＋浓度为8-10mM （2）、常用的Taqman预混酶（2X） TaqE ＋ Buffer ＋ Mg2 其中Mg2＋浓度为8-10mM 五、实验方案的选择 定量PCR实验方案 定量PCR实验方案 荧光染料法 Taqman探针法 双标准曲线法 2 -△△CT法 双标准曲线法 2 -△△CT法 五、实验方案的选择 定量PCR实验方案 （1）、染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析 的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。 （2）、探针法适合常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝) 及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变化）。 （3）、双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求 较高的实验。 （4）、 2 -△△CT法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基 因种类相对较多的实验。 根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、 经费情况等来选择合适的实验方案。 六、误差分析及操作规范 1、误差分析 （1）、实验样品间的个体差异； （2）、实验方案本身的误差； 荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差； 2 -△△CT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起 误差；探针法误差相对较小； 双标准曲线法误差相对较小； （3）、仪器设备及耗材引起的误差 测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再 到摩尔量，误差本身就很大（双标准曲线法不一定非要测标准品的 浓度）； 定量PCR仪的误差，96空板封口膜透光性的差异等。 六、误差分析及操作规范 1、误差分析 （4）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差 （5）、操作引起的误差 样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误 差。 2、操作规范 荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项 实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目 标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。 （1）、样品的选取及处理 科学地选取个体重复，以减少实验个体差异引起的误差； 尽量选取表性明显的个体作为实验对象； 处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理；选取试验样品 时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织；样品选取 好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。 六、误差分析及操作规范 2、操作规范 （2）、核酸提取 加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保 得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNA OD260/280＝ 2.0左右，DNA OD260/280＝1.8左右，最好再做电泳检测；同一样 品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。 （3）、得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放，反转录所得 cDNA要用看家基因检测。 （4）、对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做 内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。 （5）、做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管 中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。 （6）、体系中最好掺入ROX参比荧光，以消除光程偏差。 六、误差分析及操作规范 2、操作规范 （7）、重复操作 让重复操作最大的修正偏差？最有意义的重复是在提取样品RNA时 就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所 得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因 为我们是把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出 的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义 的多。