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实验六 聚丙烯酰胺凝胶 圆盘电泳分离蛋白质 简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径? 2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？ 3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？ 4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？ 5. 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺垂直板电泳？哪些是关键步骤？ 6. 如何除去凝胶中过量的AP？未反应的单体如何除去？ 一、目的要求 1.学习聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳原理和技术 2.学习和掌握圆盘电泳分离蛋白质技术 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳和垂直平板电泳具有相同的原理。 不连续： 凝胶孔径不连续性；缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；电位梯度的不连续性： 三种效应： 样品浓缩效应；分子筛效应；电荷效应 垂直平板：1、多个样品在同一块凝胶上，电泳条件一致－－便于利用各种鉴定 方法，直接比较各种样品区带，保证结果的准确可靠2、可以进行双向电泳3、电泳时热量容易消散，凝胶结果便于照相和易于制成干胶圆盘电泳：1、缺点是由于聚合效应，凝胶的长度和直径有细微差别，即使同一 样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳，其结果也会不同2、但是研究工作中还会用到圆盘电泳，例如 测定放射性标记的样品 测定蛋白质的生物活性；测定蛋白质分离的最适pH，凝胶浓度； 双向电泳中第一相的分离。 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.9 (2)浓缩胶pH6.9 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3 三、试剂的配制： 1、电极Buffer的配制：每排派一个同学配一份 2、样品溶液，染色液都已由实验室的老师配好了。 3、脱色液可在电泳的时候配制 四、凝胶的配制： （1）、分离胶[7.5%]贮液的配制： A： 称取Tris. 3.7 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；TEMED 100 μ l ；最后加蒸馏水至10ml； pH8.9即可。(TEMED最后在分离胶的混合液中加10 μl） B： 分别称取Acr 3.0 g；Bis 0.08 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 C： 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 D： 蒸馏水 分别取：A ：B ：C ：D = 1.0ml ：2.0ml ：4.0ml ：1.0ml （8.0 ml） （2）、浓缩胶[2.5%]贮液的配制： E： 称取Tris. 0.958 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml；TEMED 200 μl ；最后加蒸馏水至10. 0 ml ；pH6.9即可。 (TEMED最后在浓缩胶的混合液中加20 μl ） F： 分别称取Acr 1.0 g；Bis 0.25 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 G： 称取蔗糖4.0 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 H： 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀即可。 分别取：E ：F ：G ：H = 0.5ml ：1.0ml ：0.5ml ：2.0ml （4.0 ml） 五、操作步骤 1、分离胶的制备： （1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端（同学们应该挑选一下比较平的那头），用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.0 cm处作一记号。 （2）、用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0 cm高。 （3）、凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。 （4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。 2、浓缩胶的制备： （1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用吸水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面）然后先小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面1-2次，再小心加入该浓缩胶贮液1.5 cm高。 （2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶表面。大约也在20-40分钟后，待浓缩胶出现乳白色时，表明胶已聚合完毕。 3、加样： 取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加10ul测试样品溶液。 4