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色谱技术 ——如何选择最佳分离条件 一、色谱的任务 色谱的首要任务是分离 关键在于建立色谱分析方法——优选最佳色谱分离条件 为此要了解影响分离度的因素 掌握建立色谱分析方法——优化色谱分离条件的一般步骤 二、衡量分离的指标——分离度 分离度：Rs=1.5 —基线分离—完全分离 二、影响分离度的因素 受动力学因素和热力学因素两方面的影响 基本分离方程 1、效率因子(n) 当固定相确定以后，要使一对组分的分离达到某一分离度，柱必须具有最低限度的理论塔板数(最小柱长)。 增加柱长可以提高分离度。 减小柱的H可以提高分离度，比增加柱长更可取。 2、容量因子(k’) 容量因子(k’)增加，Rs增加。 K’合适的范围：1~20 使k’改变的方法有；改变柱温；改变流动相性质及组成(在液体色谱中)；改变相比。 3、选择性因子(α) α越大，柱选搀性越好，越能获得良分离 三个参数中，α的增加对分离度的提高最有效 改变方法：改变固定相、改变流动相、改变柱温、改变样品结构——衍生化 三、如何提高柱效 基本概念：理论塔板数n，理论塔板高度H 板高(H)越小，柱效(n)越高，峰宽(W)越窄 影响柱效的因素——速率理论 H=A+B/u+C*u 1、涡流扩散项(A) 当组分随流动相向往出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒的阻碍不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，导致谱带展宽，故称涡流扩散。 采用小颗粒固定相，填充均匀可提高柱效 2、纵向扩散(B) 纵向分子扩散指沿X轴方向的扩散，它是由浓度梯度造成的。 H2=k*Dm Dm—组分分子在流动相中的扩散系数 与流动相流速成反比 3、传质阻力项(C) 组分分子在两相之分配时受到的阻力 流动相中的传质阻力Cm=K*dp2/Dm 液相色谱中减小流动小粘度可以增大Dm 3、传质阻力项(C) 固定相的传质阻力Cs=K*df2/Ds 减小液膜厚度 减小固定液粘度 H3=Cm+Cs 键合项液相色谱中Cs可以忽略 气相色谱中Cm可以忽略 4、速率方程 H=A+B/u+C*u ——操作条件 5、其他导致峰展宽的原因 6、保护色谱柱 四、改变组分k’和α 液相色谱：改变流动相 正相色谱——吸附色谱(薄层色谱) 反相色谱——键合相色谱、反相离子对色谱(HPLC) 气相色谱： 毛细管色谱——柱温、 固定液 1、调节组分k’值 液相色谱——通过改变流动相极性调节组分k’值。 溶剂极性与洗脱能力： 正相色谱——极性强洗脱能力强，组分k’减小 反相色谱——极性弱洗脱能力强，组分k’减小 各种溶剂的极性——ε0、P’ 混合溶剂的极性 2、改变选择性(α) 根据分子间作用力将溶剂分组 不容组的溶剂选择性不同 根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性 五、确定最佳溶剂强度 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度) 五、确定最佳溶剂强度 另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范围的大概溶剂成分。 六、优化流动相的选择性 三角形优化法(反相HPLC) 正相色谱 七、离子对色谱法 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术 关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。 1、基本原理 有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。离子对的生成可由下式表示： A-水相B+水相A-B+有机相分别表示组分离子A-、平衡离子B+、离子对A-B+有机相在水相和有机相中。 1、基本原理 由于离子对具有硫水性，因而被非极性固定相(即有机相)提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。 以上这类色谱法称反相离子对色谱法。 能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多宫能团化合物的分离。 可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。 2、反相离子对色谱法 固定相和流动相 在反相离子对色谱中，采用类似于反相键合相色谱中所使用的固定相。 流动相为加有平衡离子和有机溶剂(如甲醇或乙腈)的缓冲水溶液。平衡离子为四丁铵、烷基磺酸