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基因克隆的策略及实例分析
* (6)参数 变性温度与时间 一般选择: 940C, 30秒 退火温度与时间 取决于引物长度、浓度 和G+C含量, 一般选择: Tm - 5℃ 延伸温度与时间 一般选择: 70℃ ?75℃ 循环次数 取决于模板浓度, 一般循环:30-40次 (四)PCR产物的电泳分析及纯化 1. 琼脂糖凝胶电泳分析 凝胶制备 上样 电泳 观察拍照 2. 割胶纯化 割胶 纯化 -20 ℃保存备用 (四)、免疫印迹(western blotting)法 1.原理: 在蛋白质凝胶电泳以后,用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 (1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂,使煮沸变性的蛋白质维持线性状态,并与蛋白质结合,使蛋白质带上负电荷。 ① SDS: (SDS): ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE): (Polyacrylamide gel electrophoresis) 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动,移动的速率主要取决于其分子量大小(链的长短),从而把不同分子量的肽链分开。 电泳buffer 电泳buffer 点样 电泳方向 ③蛋白质电泳的分子量标准 已知分子量的蛋白质混合液,与待测样品一起电泳,为样品蛋白质提供分子量估计。 商品化供应 Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿 Dalton SDS PAGE ④凝胶中的蛋白质染色: 考马斯亮蓝: 灵敏度底、只能检出0.3-1μg/带,但可褪色回收。 硝酸银: 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2)转到膜上进行染色。 1)直接染色 直接染色电泳结果 (2)Western blotting 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法,转到膜上(硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等)。 ① Western(转膜) 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 Western装置 ② Blotting 原理与ELISA相同。 待测蛋白 硝酸纤 维素膜 一抗 二抗 辣根过氧 化物酶 底物 产物, 并发出光 PAGE胶 待测蛋白 底片曝光 辣根过氧化物酶:HRPO 1)先用一抗(待测蛋白的单克隆抗体)与 膜上的蛋白结合。 2)洗去未结合的一抗。 3)用二抗与一抗结合(二抗上带有HRPO)。 4)清洗掉未结合的二抗。 5)用HRPO的底物浸泡膜。 6)暗室里曝光,冲洗胶片。 ③ Blotting过程 Immuno Blotting ④结果 多克隆抗体Blotting的结果 单抗blotting结果 (一)、无细胞翻译系统 六 转译筛选法 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如:麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 借助无细胞翻译系统,通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录,来筛选其产物是否符合预期。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 (二)、转译筛选 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的 甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 比较放射性 带纹的位置 载体+外源DNA 转录 与预期的产物分子量相符? (三)、杂交抑制转译法 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质(转译被抑制)。 单链mRNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 能翻译 mRNA DNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 不能翻译 1. 原理 2. 过程 (四)、杂交释放转译法 1. 原理: 在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附,然后洗脱,释放出与它对应的mRNA,进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物(如分子量、免疫源性等)。 2. 过程 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 cDNA编 码的蛋白 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 (五)、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 第四节 实例分析 根据同源基因进行PCR法克隆牙鲆功能基因 (一)查找同源基因序列,并进行比对分析,找出高度保守区。
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