罗田甜柿diospyros kaki thunb.酵母杂交cdna文库构建的及dkpdc2启动子文库筛选.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文4讨论 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 4讨论 ．38 4．1不同脱涩类型柿品种爿D日和肋C基因序列保守性和差异性 38 4．2基于启动子序列研究相关基因功能的可能性 ．39 4．3中国甜柿‘罗田甜柿’酵母杂交AD．eDNA文库构建及其意义 ．40 5进一步工作设想 41 参考文献 42 附勇乇 ．．49 致谢 ．．69 II 万方数据 罗田甜柿(Diospyros 罗田甜柿(Diospyros kaldThunb．)酵母杂交eDNA文库构建及DkPDC2启动子文库筛选 摘要 日本原产完全甜柿(简称“日本甜柿”或JPCNA)自然脱涩是随果实发育其果 肉中单宁细胞的数量相对其他鞣细胞而言所占比例下降(俗称“稀释效应”)所致， 而中国原产完全甜柿(简称“中国甜柿”或CPCNA)自然脱涩不仅与“稀释效应” 有关，而且与果实成熟前可溶性单宁向不溶性单宁的转变(俗称“凝固效应”)具有 更为直接的关系。前人研究已经明确，中国甜柿自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因 ADH和PDC密切相关。本研究选择中国甜柿‘罗田甜柿’和‘鄂柿l号’为试材， 同时以日本甜柿‘阳丰’和非完全甜柿‘磨盘柿’作为对照，首先克隆获得ADH和 PDC家族成员全长，并比较不同脱涩类型品种中该基因序列差异性：进而，通过染 色体步移法分离获得ADH和PDC家族成员启动子序列；以‘罗田甜柿’不同组织 (花、叶片、茎段、萼片、果皮、果肉、果心和种子)、不同时期(花后2．5、5、10、 15、20和25周)样品为试材，构建其酵母杂交cDNA文库；最后，基于ADH和 PDC启动子序列构建载体并用于酵母杂交cDNA文库筛选。以期筛选出与中国甜柿 自然脱涩相关的转录因子，从而为阐明其自然脱涩的分子调控网络提供科学依据。 主要研究结果如下： 1．利用NCBINucleotide数据库中获得‘磨盘柿’3个ADH(D朋朋，、DkADH2 和DkADH3)和4个PDC(D舻DCJf、JD肚DC『2、DkPDC3和D肛DC5)成员。其中 DkPDC5为部分编码区长度，且与D胜D口序列高度相似，因此后续研究以DkPDC2 研究为主。在不同脱涩类型品种中扩增出上述6个基因序列全长，其序列保守性较 强，不同品种中同一基因在DNA和氨基酸水平上仅存在少数位点变异。 2．通过染色体步移法获得部分彳DH和PDC启动子全长序列：D抒．DC2启动子 序列在两个中国甜柿品种中序列完全一致，但与日本甜柿和非完全甜柿有别，其在 ATG上游启动子核心区存在序列插入与缺失。 3．以‘罗田甜柿’不同发育时期和不同组织样品构建出酵母杂交cDNA文库， 经RNA和mRNA质量检测合格。获得的cDNA初级文库、次级文库以及最后转化 酵母187的酵母文库转化效率均为100％，平均插入片段长度均1．3 kb，总克隆数 均大于1×106。 4．以‘罗田甜柿’DkPDC2启动子结合同源重组法构建获得pPDC2．AbAi诱饵 载体；通过转化酵母Y1HGold菌株获得Y1HGold[pPDC2．AbAil阳性菌株；通过酵 母转录自激活技术获得Y1HGold[pPDC2．AbAi]菌株，其最低AbA抑制浓度为100 ng／mL。Y1HGold[pPDC2．AbAi]菌株对酵母杂交cDNA文库筛选获得大量阳性克隆， 万方数据 华中农业大学2016届硕士研宄生学位论文挑选其单克隆进行PCR检测，发现其片段长度通常1．2 华中农业大学2016届硕士研宄生学位论文 挑选其单克隆进行PCR检测，发现其片段长度通常1．2 kb之间。 综上所述，不同脱涩类型柿品种ADH和PDC在cDNA水平差异极小，但其 DkPDC2启动子序列的差异明显，推测DkPDC2启动子序列差异可能影响其基因转 录水平变化。因此，构建‘罗田甜柿’酵母杂交文库，对于在转录水平上挖掘与其 自然脱涩相关基因的研究有重要意义。 关键词：ADH；PDC；启动子；酵母杂交cDNA文库；自然脱涩；中国甜柿 万方数据 罗田甜柿(DiospyroskataYhunb．)酵母杂交eDNA文库构建及DkPDC2启动子文库筛选Abstract 罗田甜柿(DiospyroskataYhunb．)酵母杂交eDNA文库构建及DkPDC2启动子文库筛选 Abstract The mechanism of natural deastringency in Japanese pollination—constant and non-astringent(JPCNA)persimmon caused by the declined percentage of tannins cell relative to other tanning cells along、^，itl