降低mRNA翻译起始区的稳定性原核非融合表达HAb18GEF.PDFVIP

卷 期 生 物 工 程 学 报 ! ! %’ (! ) (! 年 月 !# $ !#$%% ’()*$+, (- .#(/%0$(,(12 *+,-. !# !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 降低!#$ 翻译起始区的稳定性原核非融合表达%$’()*+ 张思河 邢金良 姚西英 陈志南 （第四军医大学基础部细胞工程研究中心，西安 81$! ） 摘 要 为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原 胞外区片段（ ），将 基因的 C3D10E C3D10E;9 C3D10E;9 -F)3 插入原核表达载体 。通过计算机辅助设计，对重组的 的 翻译起始区（ ）的二 G;5!1+ H C3D10E;9I G;5!1+ H J)3 5KJ 级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和 优化密码子偏性二种策略分别来降低 的 翻译起始区（ ）的稳定性。在不改变氨基酸 C3D10E;9I G;5!1+ H J)3 5KJ 序列的前提下，利用密码子的简并性，通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和 测序验证后，转化感受态 宿主菌后，随机挑菌 下用 诱导表达。 、间接 、 L*17/F;$ $8 M KN5E OFO/N3E; ;PKO3 Q6RS6,B D’S 和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。J)3 AS D’S 对比分析优化前后目的基因J)3 的量。结 果证明，成功地构建了C3D10E;9I G;5!1+ H 及其二种优化突变体。仅优化5KJ 区二级结构或仅优化5KJ 区密码子 偏性均能实现C3D10E;9 蛋白的非融合表达，而未优化的重组子不表达任何C3D10E;9。非融合表达产物在大肠 杆菌中主要以包涵体形式存在，高达 !7 T$U 。由于过表达和细胞渗漏，培养基和周质腔中也可检测到少许的 C3D10E;9。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的 C3D10E;9 的非融合表达量基本相同。优化前后 C3D10E;9 转录的J)3 量没有差别。这些结果表明，降低 J)3 翻译起始区的稳定性可实现肝癌相关抗原 C3D10E 胞外区片段在大肠杆菌中的非融合表达。 关键词 翻译起始区， 二级结构，密码子偏性，非融合表达， 胞外区 J)3 C3D10E 中图分类号 文献标识码 文章编号 （ ） V802 3 1/$21 !# !/184/2 肝癌相关抗原 是一种高度糖基 区。胞外区 个半胱氨酸形成 个二硫键构成 C3D’0EW XF’#8 # ! KZO9 化的单次跨膜蛋 白。在不 同种属和组织 中， 典型的半球型结构域。在获得该蛋白-F)