以原核显微注射技术建立csnk1ε转基因小鼠及其表达检测-对动物官学专业毕业论文.docxVIP

以原核显微注射技术建立Csnkl￡转基因小鼠及其表达检测 以原核显微注射技术建立Csnkl￡转基因小鼠及其表达检测 细胞水平的相关检测 本研究主要利用电穿孔转染法将红色荧光蛋白表达载体pCMV．DsRed导入 MEF中，筛选出适应于MEF的最优转染条件，即160V／5Ms。利用该转染条件 将Cas9载体和sgRNA载体共同转染于MEF中，培养48h后提取基因组，通过 设计跨靶位点的PCR引物进行PCR扩增，扩增产物经杂交后再通过Surveyor 突变检测试剂盒进行鉴定，从而确定sglⅢA敲除位点为Rosa26基因的第一内 含子的第1096bp处，其敲除效率为36．52％。同理，将构建好的人源K14启动 子启动的红色荧光蛋白表达载体pKl4一DsRed，导入MEF中，通过观察红荧光 的表达情况可知该启动子具有启动功能，可用于下一步实验中。最后将hCas9 载体、sglLNA载体及打靶载体共转染于MEF中，进行PCR检测，结果表明具 备同源重组条件，可用于下一步转基因打靶小鼠的建立，同时该检测引物可用 于转基因阳性小鼠的检测。 3、Csnkl／3转基因小鼠的制备及鉴定 本研究将构建好的Csnkl／3打靶载体，根据同源重组技术原理，利用原核显 微注射法制备小鼠l 8只，通过PCR及Southern Blot鉴定后得到Csnkl l；随机整 合阳性小鼠1只，并未得到Csnkl￡定点整合的阳性小鼠。随机整合阳性小鼠通 过传代得到F1代阳性小鼠1只，说明该转基因阳性小鼠能够将外源基因稳定遗 传给子代。本实验成功构建出Csnkl／3转基因小鼠模型，为以后研究该基因的功 能创造了实验条件。 4、Csnkl￡转基因小鼠表达水平的检测 本实验首先对转基因阳性小鼠进行了mRNA水平的检测，以GAPDH为内参 基因，通过Real．time PCR检测结果为：转基因阳性小鼠Csnkl／3 mRNA表达量 万方数据 内蒙古大学 内蒙古大学 硕士学位论文 是同窝对照小鼠的2．65倍。然后对其进行蛋白质水平的检测，以Q．tubulin为内 参基因，通过Western Blot检测结果是同窝对照小鼠的1．243倍。通过上述检测 手段，说明目的基因已经成功转入小鼠的基因组并稳定表达。 关键词： CRISPR．Cas9；Csnkl；同源重组；原核显微注射 万方数据 以原核显微注射技术建立Csnkl￡转基因小鼠及其表达检测GENERATION 以原核显微注射技术建立Csnkl￡转基因小鼠及其表达检测 GENERATION 0F CSNKl EPSILON OVEREXPRESSION TRANSGENIC MICE BY PRONUCLEAR MICROINJECTlolN AND ITS DETECTION ABSTRACT Casein Kinase 1(Csnk 1)belongs to the serine—threonine protein kinase． Mammals have seven family members，they are alpha，beta 1，gamma 1，gamma 2， gamma 3，delta，and epsilon．It has been suggested that the deletion or the mutation of Csnk l epsilon may have an effect on the hair follicles development and growth． CRISPR／Cas system is derived from a natural adaptive immune system in bacteria that the system can modify the target gene by RNA guidance Cas protein．For further investigation in Csnk l epsilon on the role of the hair follicles’growth，in this study we designed a CRISPR／Cas9 system makes Csnk l epsilon knock in rosa26 site in the murine genome．Then a Csnkl epsilon overexpression transgenic mice were produced by pronuclear microinjection techniques．A positive mouse was identified by PCR and Southern blot，and the expr