慢病毒论文：人膜联蛋白a10基因过表都达慢病毒的构建及其对人肝癌细胞株hepg2体外效应的研究.docVIP

慢病毒论文：人膜联蛋白A10基因过表达慢病毒的构建及其对人肝癌细胞株HepG2体外效应的研究 【中文摘要】1、构建人膜联蛋白A10基因(annexinA10, human, ANXA10)和增强绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescence protein,EGFP)融合基因的重组慢病毒；2、通过检测重组慢病毒对人肝癌细胞株HepG2凋亡、增殖的影响及其对HepG2细胞中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达的影响。初步阐明膜联蛋白A10基因在人肝癌增殖、凋亡及转移中的作用。方法：1、针对已经筛选确定的ANXA10基因并将基因克隆转入到慢病毒载体表达质粒PGC-Fu中,通过酶切、测序验证ANXA10基因后,将PGC-Fu-ANXA10质粒和包装质粒pHdper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带ANXA10基因和GFP基因的重组慢病毒PGC-Fu-ANXA10。2、体外实验中,将上述慢病毒以最适MOI转染人肝癌细胞株HepG2,分成ANXA10-慢病毒组、慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组。荧光显微镜观察GFP表达以确定转染效率,采用RT-PCR在mRNA水平检测ANXA10基因表达的变化,采用Western blotting在蛋白质水平检测ANXA10基因表达的变化,以明确ANXA10对人肝癌细胞株HepG2的抑制作用,通过流式细胞技术及MTT法测定其对人肝癌细胞株HepG2凋亡及增殖情况,并运用同样的方法分别从mRNA和／或蛋白质水平检测MMP9、VEGF表达的变化。结果：1、成功构建人ANXA10基因过表达慢病毒,测序验证序列正确,经包装产生的病毒滴度为2E+8。2、人ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2,在转染后3-4d GFP接近高峰,转染率达70%。MOI值=10是最适的MOI值,加polybrene使其终浓度为5μg/ml,转染效果更佳。3、人ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2 72h后的增殖情况分析,ANXA10-慢病毒组于转染72h后HepG2细胞的体外增殖抑制率达24.646%,与慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组比较差异有统计学意义(P0.05)；凋亡实验显示,ANXA10-慢病毒组细胞凋亡率为51.92±1.41%,慢病毒空载组细胞凋亡率为19.00±1.12%,HepG2细胞未转染组细胞凋亡率为3.59±0.89%,ANXA10-慢病毒组明显高于慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组(P0.05)。4、转染HepG2细胞后,采用半定量RT-PCR技术及Western blotting技术检测结果显示,与慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组比较,ANXA10-慢病毒组中ANXA10mRNA及ANXA10蛋白表达明显升高(P0.05)。5、人ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2后,显示ANXA10-慢病毒组MMP-9、VEGF mRNA和蛋白的表达量较慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组相比均明显下降(P0.05)。结论：1、人ANXA10基因过表达抑制人肝癌细胞株HepG2增殖并促进其凋亡。2、人ANXA10基因过表达能下调HepG2中肝癌侵袭转移相关的细胞因子MMP-9、VEGF的表达,并可能由此进一步抑制肝癌的侵袭转移。 【英文摘要】:1. To construct human annexin-10 (ANXA10) and Enhance green fluorescent protein (EGFP) fuse gene of recombinant lentiviral;2. To examine the effects on cell apoptosis and proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cell which transfected by recombinant lentiviruses and effect on the expreession of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)、vascular endothelial growth factor(VEGF). Initially illuminated the effects of ANXA10 gene on h