第七章高效液相色谱分析.pptVIP

学习目标 1、掌握HPLC的分离原理、高效液相色谱分析的样品处理方法、分离方式的选择和定量分析方法及HPLC实验技术。 2、了解高效液相色谱仪的构造、仪器各部分的功用及仪器的维护和保养，熟悉其工作过程及常用固定相及流动相的特性及选用原则。;一、液相色谱分离原理;2、液相色谱法分类;1）液-液分配色谱法（LLC） 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异实现分离。 固 定 相： 载体+固定液（物理或机械涂渍法）。 缺 点：系统内部压力大，易流失，不实用。 极性固定液→NLLC，非极性固定液→RLLC 正相色谱——固定液极性 流动相极性（NLLC），极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱， 适于分离极性组分。 反相色谱——固定液极性 流动相极性（RLLC）， 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱，适于分离非极性组分。;2）液-固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂。 分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异实现分离。 3）离子交换色谱法（IC） 分离机制：离子交换树脂上可交换的离子基团与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据其对离子交换树脂上的固定离子基团亲和力的不同而将溶质分子分离。 离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱； 四丁基季胺盐→分析酸 4）空间排阻（凝胶）色谱法 以凝胶为固定相的色谱法。 分离机制：溶质自身体积大小不同，透过凝胶的速率不等。; 高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。 高效液相色谱也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。;1、高效液相色谱的特点 　　高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 　　高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 　　高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 　　高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 ;2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点 　　速度快——通常分析一个样品在15～30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 　　分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 　 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 　　色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 　　样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。;三、HPLC的实际应用;第二节 高效液相色谱仪的基本构造;高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统;一、高压输液系统;马达;1、贮液装置----提供足够数量、符合要求的流动相，以完成分离分析任务。 流动相须经过脱气处理（加热、减压、超声波、惰性气体置换）。脱气指驱除溶解在溶剂当中的气体。（1）脱气是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡。这些气泡进入检测器后会使噪声剧增，甚至不能正常检测。（2）溶解氧会与某些流动相与固定相作用，破坏它们的正常功能。对水及极性溶剂的脱气尤为重要，因为氧在其中的溶解度较大。 2、高压泵----输出流动相 要求较高的输出压力且压力平稳、流速恒定、流量可调。当高压流动相通过分离柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用;3、过滤器----对流动相进行过滤，以消除微小的机械杂质。 4、洗脱装置 梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 低压梯度洗脱 高压梯度洗脱 5、阻尼器----减少流动相流量的波动，亦称缓冲器。 ;二、进样系统; 该系统包括色谱柱（柱管、固定相填料、密封垫）、连接管和恒温器等。