两个马铃三薯y病毒株系全基因组序列及侵染烟草植株后solexa转录组测序分析.docxVIP

2．1．2植物材料 2．1．2植物材料 ．13 2．1．3质粒 13 2．1．4酶与各种生化试剂 ．13 2．1．5引物 14 2．2实验方案 ．15 2．2．1病毒的纯化 ．15 2．2．2生物学检测 ．15 2．2．3马铃薯Y病毒两个分离物全基因组序列测定及序列分析 17 2．2．4 Solexa高通量测序 ．24 2．2．5 Real．Time PCR验证测序结果 ．．25 3．结果与分析 27 3．1马铃薯Y病毒两个分离物的分离纯化与全序列测定 27 3．1．1 PVY分离纯化与检测 27 3．1．2 PVY分离物基因组的分段扩增 28 3．1．3筛选重组质粒 ．30 3．1．4 PVY分离物序列测定 30 3．1．5全基因组序列分析 ．30 3．1．6系统进化分析 一32 3．2 Solexa高通量测序结果 34 3．2．1测序数据统计分析及参照注释 ．34 3．2．2部分差异表达基因分析 ．34 3．2．3 GO富集显著性分析 41 3．2．4 Pathway富集显著性分析 41 3．2．5 qRT．PCR对测序结果的验证 43 4．讨论 44 5．结论 47 参考文献 一48 豸[谢 60 攻读学位期间发表论文情况 ．．61 Ⅱ 万方数据 山东农业大学硕士学位论文中文摘要 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 烟草是国家财税收入的重要来源之一，烟草行业是影响中国经济最广泛的行业。 马铃薯Y病毒(Potato virus L PVY)是烟草上危害最为严重的病毒之一。根据生物学 症状、血清学反应特性和核苷酸序列，可将PVY分为不同的株系：普通型(Common or Ordinary strain，PVYo)，烟草叶脉坏死型(Tobacco veinal necrosis strain，PVY’N)， 点条斑型(stipple streak strain，PVYc)以及PvYZ和PVYE。病毒株系和品种的不同， 表现出的症状特点也有明显的差异。较为普遍的pvvo侵染烟草，在发病初期，叶片 会出现“明脉”，后网脉的脉间则颜色变浅，表现为花叶症状；pvys侵染烟草，病株 叶脉则变成暗褐色至黑色坏死，叶片呈现污黄褐色，有时候坏死部分则延伸至主脉和 茎的韧皮部，表现为脉坏死症状。二者在致病症状上有明显差异，目前对马铃薯Y病 毒普通株系和致死株系致病差异性的机理尚不明确。 从山东感病的烟草中分离得到两个PVY分离物，分别命名为PVY．T和PVY．G。 5’RACE(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)及RT-PCR(Reverse transcription PCR,RT．PCR)克隆两个PVY分离物的基因组全序列。比对PVY．T、PVY．G全基因 组序列发现，全基因组序列都为9665个核苷酸，PVY．T的全基因组序列的5’．非翻译 区由170个核苷酸组成，ORF含有9183个核苷酸，编码3061个氨基酸，3’．非翻译区 包含312个核苷酸。而PVY．G的全基因组序列的5’．非翻译区由164个核苷酸组成， ORF含有9171个核苷酸，编码3057个氨基酸，3’．非翻译区包含330个核苷酸。二者 的全基因组核苷酸序列一致率为88．96％，氨基酸序列一致率94．35％。一致率差异较大 部分为P1、HC—Pro、NIa．VPg、NIa、NIb 5个蛋白。氨基酸序列的进化树分析表明， PvY_T分离物属于pVyN株系，PVY．G分离物属于pvyo株系。 利用Solexa高通量测序技术，对两个马铃薯Y病毒分离物侵染后的烟草叶片和健 康的叶片的cDNA文库进行差异基因表达谱分析，结果显示，在三个数据库中分别测 出了9,923，807、8,749，219、6，805，228个序列。PVY．T侵染的烟草植株相比对照植株 (T．CK)有2221个上调和432个下调的基因；PVY．G侵染的烟草植株相比对照植株 (G．CK)有2118个上调和716个下调的基因，进一步比较PVY—T处理组与PVY．G 处理组(T．G)的测序结果，发现有241个上调和33个下调的基因，其中未知基因约 占14．6％。通过比较T．CK与G．CK，我们发现，有5个基因在高通量测序结果中表现 为异向调控：过氧化物酶、新薄荷还原酶、假设蛋白POPTRDRAFT一783792、CPl2、 万方数据 两个马铃薯Y病毒株系全基因组序列的克隆及侵染烟草植株后Solexa转录组钡9序分析LTPl前体。它们的异向调控表明PVY．T、PVY．G侵染植株后导致了寄主部分基因的 两个马铃薯Y病毒株系全基因组序列的克隆及侵染烟草植株后Solexa转录组钡9序分析 LTPl前体。它们的异向调控表明PVY．T、PVY．G侵染植株后导致了寄主部分基因的 异向表