免疫细胞功能检测技术.ppt

(一) 细胞运动功能——趋化功能检测 1.原理： 2. 方法： 琼脂糖平板法 滤膜渗透法（Boyden 小室法） (二)吞噬和杀菌功能测定 1．显微镜检查法： 2. 溶菌法 NBT还原试验 原理： N-N- C + H+ N=N-R- N-NH2 C N=NH 四氮唑基（淡黄色） 甲臜（紫黑色） 3．NBT还原试验 中性粒细胞 NBT 甲臜颗粒沉积于胞质中 二、巨噬细胞功能检测 (一)炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。 (二)吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。 (三)巨噬细胞溶酶体酶的测定 1．酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法 2．非特异性酯酶的测定 常用α-萘醋酸法 (四) 细胞毒作用测定 用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。 (五) 巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。 Thanks！ * * 免疫细胞功能检测技术 一 淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 淋巴细胞 T细胞（负责细胞免疫功能） B细胞（执行体液免疫功能） NK细胞（非特异性免疫作用） 一、T细胞功能的检测 T细胞增殖试验 T细胞分泌功能测定 T细胞介导的细胞毒试验 体内试验 （一）T淋巴细胞增殖试验 1. 原理： 淋巴细胞 DNA合成 分化 母细胞 刺激物 细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松 未转化和转化淋巴细胞的形态特征 转化的淋巴细胞 未转化的淋巴细胞 淋巴母细胞 过渡型 细胞大小(直径μm) 12～20 12～16 6～8 核大小、染色质 增大、疏松 增大、疏松 不增大、密集 核仁 清晰、1～4个 有或无 无 有丝分裂 有或无 无 无 胞质、着色 增多、嗜碱 增多、嗜碱 极少、天青色 浆内空泡 有或无 有或无 无 伪足 有或无 有或无 无 2. 淋巴细胞转化的刺激物 非特异性刺激物： PHA ------T细胞 ConA -------T细胞 PWM -------T、 B细胞 LPS -------B细胞 特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原 3. 检测方法 形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天） 母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h） DNA合成期 + 3HTdR掺入 收集细胞 ? 检测β射线 测定细胞内的3H－TdR （1）形态学检查法 方法学评价： 优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。 缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。 培养液 3H-TdR PHA 淋巴细胞 全血 分层液 离心 过滤 测量放射性 （2）3H-TdR掺入法 优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。 培养液 3H-TdR PHA 淋巴细胞 全血 分层液 离心 过滤 测量放射性 MTT 测吸光度 (3) MTT 比色法 (二) T细胞分泌功能测定 体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。 （三）T细胞介导的细胞毒试验 1.原理： 靶细胞