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考试题型：填空：30分；名词解释：24分；问答题：36分；设计实验步骤：10分。 绪论 基因工程的概念 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种新的育种技术. 二、基因工程的历史 1.1972年，美国斯坦福大学Paul Berg及同事利用限制酶将大肠杆菌DNA处理后与病毒DNA连接，第一个重组DNA分子的构建。 2.1973，Cohen Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化。 3.基因工程发展阶段的几个重要事件：1977年，Sanger双脱氧终止测序方法；1981年，第一个转基因哺乳动物小鼠；1982年，基因工程胰岛素；转基因烟草；1983年，Kary Mullis的PCR技术；1985年，基因工程微生物杀虫剂；1990年，基因治疗进入临床试验，转基因棉花商业化生产； 三、基因工程的内容（P9） 1.基因操作：是指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。将基因作为一段DNA分子来操作，进行分析、修饰或转移，属于生物化学或遗传学的范畴，只有当基因能够进行大量、可操作性的扩增时才进入基因操作的范畴。基因操作和基因克隆密不可分，核心部分为克隆（cloning）。 包括：DNA和RNA的操作、基因克隆及基于组学和信息学的基因操作 2.基因工程应用：生物反应器、遗传改良、基因治疗 四、基因克隆的通用策略 酶切、酶连、转化、筛选 分子克隆工具酶 限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 主要特征 I型 II型 III型 功能 限切/修饰 限切 限切/修饰 蛋白结构 异源三聚体 单体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 TGAN8TGCT AACN6GTGC 旋转对称序列 GAGCC CAGCAG 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内 距识别序列下游 24-26bp处 其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。 特点：识别、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶；识别序列为4-6碱基对的回文对称结构（旋转对称结构）；单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性；切割产物末端：5’突出末端、3’突出末端、平头末端；最适温度：大多为37℃,适盐浓度：高盐、中盐、低盐；当反应条件不适合时，识别和切割序列发生变化（星星反应）。 命名：以提取这类酶的生物的属名和种名的第1、2个字母以及菌株代号来命名。 粘性末端、平末端、同裂酶、同尾酶、星星活性、DNA物理图谱 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列，但是切割的序列可能不同。（同序同切酶、同序异切酶、同功多位及其他P24）. 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。 星星活性出现频率因采用的限制性核酸内切酶、底物DNA和反应条件的不同而不同。产生原因：反应系统中甘油含量过高；pH和盐浓度不适等。 DNA物理图谱（限制性图谱）：当一种DNA分子的核苷酸序列被全部测定后，此DNA分子上所有的限制性核酸内切酶的识别序列则全部知道，可以绘制出DNA分子上每种限制性核酸内切酶的识别序列分布图 大肠杆菌中甲基化酶的种类、依赖于甲基化的限制系统 大肠杆菌中甲基化酶：Dam甲基化酶可以在GATC序列中的腺嘌呤N6位置引入甲基；Dcm甲基化酶可识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基；Ecok I甲基化酶，识别AAC（N）6GTGC或TTG（N）6CACG中A的N6位置，因识别位点少（1/8kb）而研究较少， Dam（1/256bp）Dcm（1/512bp）。 SssI甲基化酶来自原核生物Spiroplasma sp.，可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。SssI