第十章 新酶的发现与筛选.ppt

1、 基因组狩猎法 基因组数据 * * 第10章 新酶的发现与筛选 截至 2012 年 8 月，基因数据库( Genbank) 已经有超过 1 亿 3900 万个核酸序列，它们来自 488 266 个物种的基因组，其中包括 3 450 个完成测序的微生物基因组。 示例1 基因组序列搜索 查找基因组序列：Kluyveromyces lactis 搜索基因组序列中的还原酶 reductase * * 第10章 新酶的发现与筛选 2、 基因挖掘法 基因组狩猎原理 * * 第10章 新酶的发现与筛选 以已知酶为探针，与整个数据库的酶进行比对，获得中等相似度（50%~70%）的酶进行克隆表达，通过功能筛选并获得所需要的酶。 * * 示例2 数据库比对寻找相似酶序列 酶探针的氨基酸序列 * * 第10章 新酶的发现与筛选 NADPH-dependent alpha-keto amide reductase [Kluyveromyces marxianus] GenBank: BAP73216.1 1 MTNQKFFTLS NGNKIPAVAV VGTGTKWYKA EETDATFSQE LTDIVKLSLD TVPGIVHIDA 61 AETYKTYPEL GAALKETKKP REEIFITDKF SSLHKISEDP KSALETALKK LGVDYVDLYL 121 IHSPFFDKDL NIDLETAWKQ LEELYKSGKA KNIGVSNFTV EDLKKVLAIA EIKPQVNQIE 181 FSPFLQNQTP GIVEFSQKND ILLEAYSPLG PLQKKPADAD QQPFYQYLKE LSEKYNKTEA 241 QVLLLWVYKR GILPVTTSAK IERIKQAQDI FSFDLTEEEV KKITDLGLQH EPVRLYWVDF 301 YTKYNSEAQK 六、 宏基因组筛选 宏基因组 * * 第10章 新酶的发现与筛选 宏基因组是特定小生境中全部遗传物质的总称。通过宏基因组提取可以获得实验室条件下不能纯培养微生物的基因序列，大大提高微生物资源的利用率 * * 宏基因组文库构建 * * 传统筛选途径与宏基因组筛选过程比较 3、 从自然界筛选产酶微生物 从基因克隆库筛选 * * 第10章 新酶的发现与筛选 克隆库构建方法： 基因组狩猎 基因挖掘 宏基因组筛选 三、 新酶筛选的策略 新酶筛选的一般规律（原则） * * 第10章 新酶的发现与筛选 筛选前回答三个问题 明确反应目标：筛选什么酶？ 在合适的微生物群体中筛选：从哪里筛？ 确立高效筛选方法：用什么样的筛选方法？ 三、 新酶筛选的策略 1、筛选什么样的酶 * * 第10章 新酶的发现与筛选 根据需要实现的化学反应，选择所需酶的类型 了解化学反应对于酶性质的要求，比如对温度、pH、盐浓度等的耐受力等 三、 新酶筛选的策略 2、从哪里筛 * * 第10章 新酶的发现与筛选 主要筛选对象：水体和土壤 采集场所： 淀粉酶产生菌：面粉厂周围 纤维素酶产生菌：腐败树叶层下 脂肪酶产生菌：油脂厂附近 蛋白酶产生菌：蚕丝、豆饼等腐败变质的地方 嗜极微生物：火山口、盐碱地、深海、极地冰层下等 三、 新酶筛选的策略 3、筛选方法 （1）分级筛选法 * * 第10章 新酶的发现与筛选 初筛：迅速定性或粗略定量鉴别，除去大多数不符合要求的菌种或酶。平板筛选法、多孔板法等 复筛：精确测定酶活，筛选出需要的酶或产酶微生物。常采用HPLC或GC 三、 新酶筛选的策略 3、筛选方法 （2）高通量筛选法 * * 第10章 新酶的发现与筛选 方法：多孔板培养微生物，并用酶标仪进行光谱分析。 原理：反应产物具有吸收峰值，发光或产生荧光。 四、 从自然界筛选产酶微生物 * * 第10章 新酶的发现与筛选 筛选流程 四、 从自然界筛选产酶微生物 1、样品采集 * * 第10章 新酶的发现与筛选 方法：根据所要实现的化学反应确定需要的酶及产酶微生物的类型，选择采样环境 土样采集方法：除去表层土，取离地面5~15 cm处的土样，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中，扎紧，标明时间、地点、天气和周围环境等信息。 四、 从自然界筛选产酶微生物 2、富集培养 * * 第10章 新酶的发现与筛选 目的：使目的菌株大量繁殖，成为优势菌株 原理：根据微生物的特点，“投其所好”或“取其所抗”，在培养基中投放或添加特殊养分或抗菌物质，使天然环境中劣势菌转变为人工环境中的优势菌。 富集培养方法 （1）控制培养基的营养成分 * * 第10章 新酶的发现与筛选 在培养基中加入一定量底物，筛选生长优势菌株 加入底物作为唯一碳源或氮源 逐步提高底物添加浓度，连续富集培养 用不同的培养基筛选不同类型的微生物