单体红色荧光蛋白基因dsred2的克隆原核表达特性及其生物信息分析作物遗传育种专业论文.docxVIP

学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标记和致谢的部分外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得任何教育机构的学位或学历而 使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。 研究生签名：斑璋墼： 日期：边竖生』旦丝旦 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下所完成的学位论文，学校有权保存其电子和纸制文档，可 以借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密论文，按 保密的有关规定和程序处理。 本学位论文属于： 1．保密 2．不保密彩 研究生签名： 日期：翟z笸每旦雄 万方数据 摘要本研究用从质粒pDsRed2，1中分离的红色荧光蛋白基因DsRed2构建了原核 摘要 本研究用从质粒pDsRed2，1中分离的红色荧光蛋白基因DsRed2构建了原核 表达载体pGEX4T-1．DsRed2，进行了原核表达，并对目的蛋白的生物信息进行 了分析，结果表明： [1]从质粒pDsRed2．1中分离的含有红色荧光蛋白基因DsRed2的目标DNA片段， 序列长度为680bp，含有678bp构成的开放阅读框(ORF)。与参考序列 Ref DsRed2．DNA相比，所克隆的含有目的基因DsRed2的DNA片段在其OI讧 内，从起始密码子的第1个碱基起，下游第537个碱基由C突变为T，使第 179个密码子从TCC(UCC)变为TCT(UCU)，两者的序列一致性为99．85％。克 隆的含有目的基因DsRed2的DNA片段在其ORF内存在的单碱基突变属于同 义突变，所编码的目的蛋白氨基酸序列不变，序列一致性为100％。 [2】目的基因DsRed2编码由225个氨基酸组成的蛋白RFP2；该蛋白属于荧光蛋 白超级家族。该蛋白无信号肽，不涉及合成后的转运。 [3]RFP2蛋白氨基酸序列包含5个疏水区和5个亲水区，前者都比较小、且由弱 亲水部分所构成，而后者都很大、且由强亲水部分所构成；该蛋白亲水性氨 基酸残基数量是疏水性氨基酸残基数量的2．2倍，其总亲疏水性值为．129．9； 该蛋白的氨基酸序列经高级折叠形成的疏水内核较小，疏水性氨基酸残基被 裸露于外部的亲水性氨基酸残基所包埋、大部分序列构成了亲水表面、形成 亲水的蛋白颗粒。 [4]禾lJ用目标DNA片段构建的DsRed2的原核表达载体pGEX4T-1．DsRed2，目的 基因DsRed2正确插入到原核表达载体pGEX4T-1的GST标签基因的下游， 目的基因DsRed2与GST标签基因形成无移码突变的可连续阅读的开放阅读 框，两者构成GST．DsRed2融合基因。 [5]DsRed2基因不仅在表达菌株BL21(DE3)中能够表达，而且在克隆菌株DH5a 中也能够表达。在BL21(DE3)中RFP2的表达量，在1，5h范围内，随诱导时 间的延长而迅速增加，此后增加不明显；诱导3h时，目的蛋白的积累量己非 常充足。 [6]RFP2在细胞中有一定的可溶性，但大部分RFP2以难溶性包涵体形式存在， 且能正常显示出红色荧光。RFP2为单体蛋白，无需形成多聚体且无需特殊光 源激发，在自然光下即可呈现出红色荧光。 关键词：DsRed2；红色荧光蛋白RFP2：单体；原核表达；包涵体；生物信息。 万方数据 AbstractIn Abstract In this study,cloning and prokaryotic expression of DsRed2 gene encoding red fluorescent protein RFP2 from pDsRed2-1 were conducted，the prokaryotic expression vector pGEX4T-1-DsRed2 was constructed and the bioinformation of the protein was analysed．The results showed that [1]DNA sequence of target gene DsRed2 encoding a red fluorescent protein in pDsRed2-1 is 687bp，which involves a complete and functional open reading frame(ORF)．Compared with the reference