基因工程的原理和技术50658.pptVIP

问题：获取目的基因的方法有哪些？ 构建基因组文库，获取目的基因 思考：基因文库如同国家图书馆，而cDNA文库则像某单位的图书馆，二者除了大小不同之外，还有哪些区别？ 问题：获取目的基因的方法有哪些？ 问题：获取目的基因的方法有哪些？ 问题：获取目的基因的方法有哪些？ 思考：PCR技术扩增目的基因，需要什么前提和条件？过程如何？原理是什么？ 人工基因合成法 基因工程的基本操作程序 典型例题1： 检测转基因生物体内是否已含有目的基因 同理： 核酸分子杂交技术 按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关 思考：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基因完成了表达吗？ 检测目的基因是否已转录出了mRNA 检测转基因生物体内是否已含有目的基因 检测目的基因是否已转录出了mRNA 检测目的基因是否已翻译出了蛋白质 利用抗原--抗体的特异性结合 按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关 问题：如何运用抗原抗体特异性结合的原理检测目的基因是否翻译出了蛋白质？ 检测目的基因是否已翻译出了蛋白质 利用抗原--抗体的特异性结合 将目的基因表达出的蛋白质作为抗原 制备抗体 检测转基因生物体内是否已含有目的基因 检测目的基因是否已转录出了mRNA 检测目的基因是否已翻译出了蛋白质 检测个体是否具有目的基因所对应表现型 按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关 问题： 除了上述分子检测外，你能否在个体生物学水平上进行检测？例如，如何检测转基因抗虫棉具有抗虫特性？ 转基因 抗虫植物 　　用棉花叶片饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。 (四)目的基因的检测与鉴定 1.目的基因是否导入： (1)标记基因检测法。 (2)DNA分子杂交法(DNA探针检测法) 2.目的基因是否表达： (3)是否出现目的基因所控制的性状: (2)是否翻译合成了蛋白质： 抗原抗体杂交检测法 核酸分子杂交法 （1）是否转录出了信使RNA： 观察法 体内DNA复制 体外PCR扩增 模板 解旋 引物 酶 DNA分子 目的基因 解旋酶 高温（加热至95℃） RNA引物 DNA引物 解旋酶、DNA聚合酶等 TaqDNA聚合酶 DNA合成仪 PCR扩增仪 一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 问题：怎样将目的基因与质粒进行重组？ 质粒 目的基因 限制酶 DNA连接酶 重组DNA 同一种限制酶切割 质粒 外源基因 重组DNA分子 （重组质粒） DNA连接酶 问题2：形成的重组质粒导入受体细胞后，除了能够稳定存在外，并且可以遗传给下一代。同时，使目的基因在受体细胞中表达和发挥作用，需要对重组质粒作怎样的修饰？ 据图回答：一个表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有哪些基本元件？ (二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体) 基因表达载体的组成 启动子 目的基因 终止子 复制起点 标记基因 一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子（基因表达载体）。 用BamHⅠ对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？ 含目的基因的DNA片段 载体 BamHⅠ BamHⅠ DNA连接酶 重组体 载体自连 目的基因 自连 双酶切连接： 思考：如何 避免质粒和目的基因的自身环化？ 1、避免载体和目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连接 2、提高重组DNA分子的重组率 (三)将目的基因导入受体细胞 (二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体) 一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 重组质粒 大肠杆菌的拟核 目的基因 氨苄青霉素抗性基因（标记基因） 将细菌用CaCl2处理，使细胞处于感受态，可促进细胞吸收DNA分子 如果是导入微生物（如细菌） 感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。 处于感受态的细胞称为感受态细胞. CaCl2 0℃ 重组载体 感受态细胞 42℃ 如果是导入微生物（如细菌） (三)目的基因导入受体细胞 1. 转基因微生物 重组DNA分子 (基因表达载体) CaCl2处理 感受态细菌细胞 (工程菌) 目的基因随受体细胞的繁殖而复制 增大细胞壁通透性 (二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体) 一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 吸收DNA分子 重组 DNA进入细菌细胞 如果是导入动物细胞 显微注射仪 受精卵 思考： 培育转基因动物时，受体细胞能否采用