杀螟硫磷重组单链抗体研究植物学专业论文.docxVIP

中文摘要摘 中文摘要 摘 要 基因工程抗体(genetically engeering antibody)是人们利用基因重组技术，在 基因水平上对抗体分子进行有目的切割、拼接、修饰，或直接进行基因序列合成， 再将重组基因导入受体细胞表达产生出的一类抗体。其中单链抗体(singe．chain variable fragment，ScFv)已被广泛应用于医学领域，因为它具有低或无免疫原性、 组织穿透力强、相对分子质量小、可大规模生产等特点。单链抗体制备方法有核 糖体展示技术和噬菌体展示技术等。其中核糖体展示技术由于具有库容量远比噬 菌体展示文库大、完全在体外进行、建库和筛选方法简便等优点，并且还可通过 突变或重组技术来提高重组抗体的亲和力，因而显示出了诱人的发展前景。 有机磷农药(Organophosphorus pesticides)是我国目前在农业生产上使用较多的 一类化学农药，农产品上有机磷农药的残留直接危害人们身体健康。必须对农产 品中的有机磷残留进行严格检测。目前对这类农药的残留分析一般采用气相色谱 法等仪器分析法检测。但这些方法必须对样品进行复杂的纯化处理，且操作者必须 经过严格的专业培训，不适合现场操作。近年来，被广泛用于小分子化合物定量分 析的免疫分析法为有机磷农药残留的快速检测提供了可能，获得高亲和力和高特 异性且廉价的抗体是免疫分析操作的关键，目前还没有应用核糖体展示技术制备 抗有机磷的高亲和力单链抗体的报道。本研究利用核糖体展示技术筛选具有高亲 和力和高特异性的抗杀螟硫磷的重组单克隆抗体。 本研究用杀螟硫磷．BSA免疫BALB／c小鼠，构建了抗杀螟硫磷单链抗体文库， 用杀螟硫磷．OVA作为筛选抗原，应用核糖体展示技术筛选特异于杀螟硫磷的单链 抗体，然后将筛选的单链抗体基因表达、纯化，并研究其特异性与亲和力。制备 的重组单链抗体为杀螟硫磷的快速检测奠定了基础，该单链抗体可用于杀螟硫磷 的ELISA(酶联免疫分析)检测，也可用于杀螟硫磷的免疫传感器的制备。主要 研究结果如下： ①用重氮化法分别合成了免疫抗原杀螟硫磷．BSA和筛选抗原杀螟硫磷 ．OVA。 ②利用杀螟硫磷．BSA免疫BALB／e小鼠，免疫后小鼠抗血清效价为2500倍 左右，符合建库要求。 ③提取小鼠脾细胞RNA，经RT-PCR构建的单链抗体文库轻链为700bp左右， 重链为400bp左右，经连接肽连接后所得到的单链抗体大小约为1．1kb。测序结果 表明，单链抗体序列为开放阅读框。它们的的互补决定区都互不相同，说明所构 建的ScFv文库多样性好，可进行下一步的单链抗体的筛选。 重庆大学博士学位论文④将构建的ScFv文库经体外转录／翻译后，产生了三元复合体(单链抗体． 重庆大学博士学位论文 ④将构建的ScFv文库经体外转录／翻译后，产生了三元复合体(单链抗体． 核糖体．mRNA，ARM)文库。用杀螟硫磷．OVA对产生的ARM三元复合体进行亲 和筛选，洗涤后，使保留的三元复合体解离，再对释放的mRNA进行RT-PCR扩 增获得筛选后的ScFv DNA文库，重复上述过程，得到经三轮筛选后的ScFv DNA 文库。 ⑤将原始ScFv文库DNA和经过三轮筛选的ScFv文库DNA分别与噬菌体 表达载体pPOW3．0相连接后，转入大肠杆菌DH5a中表达。然后后用间接ELISA 分析单链抗体与杀螟硫磷．OVA的结合活性。结果表明从原始ScFv文库中随机挑 取的50个克隆子的表达产物与杀螟硫磷．OVA几乎没有结合能力；而从经过三轮 筛选后的ScFv文库中挑取的100个克隆子中有25％与杀螟硫磷一OVA有较好的结 合能力。从三轮筛选后的ScFv文库中共挑取了190个克隆子，用间接ELISA法初 筛到50株抗原阳性的ScFv。然后用生物传感技术对ELISA筛选呈阳性的ScFv进 行了复筛，获得了3株高亲和力的单链抗体(ScFv．AF50、ScFv—AF93和 ScFv．AFl32)，用于下一步的表达、纯化和分析。 ⑥将筛选的抗原阳性ScFv进行了特性研究。单链抗体(ScFv．AF50、 ScFv．AF93和ScFv．AFl32)特异性强、亲和力高。杀螟硫磷对它们的ICso分别为 1．6、3．4和2．2 I∥ml，检测限分别是O．02、0．07和0．01 ng／ml。它们与其它有机 磷(甲基对硫磷、乙酰甲胺磷、马拉硫磷、乐果、三唑磷、毒死蜱)交叉反应低， 除了与甲基对硫磷有一定的交叉反应(Q．8％)，其余的均小于0．1％。Biacorc分 析其亲和力表明，单链抗体ScFv．AFS0、ScFv．AF93和ScFv．AFl32的解离平衡常 数分别为4．56×10doM、1．42×10。9M和2．66x10。10M。 ⑦分析了ScFv基因的序列特征。IMGT(intemationa