组织DNA提取和纯化.pptVIP

1 组织DNA提取和纯化 组织总RNA的提取和纯化 核糖核酸（ribonucleic acid,RNA） RNA是在细胞核中，利用DNA作为模板合成的化学物质。在蛋白质合成中，几种不同形式的RNA起着重要作用。 RNA的构成和种类 构成： 磷酸盐;核糖;碱基 80~85% ——rRNA（主要是28S、18S、5S rRNA） 10~15% ——分子量不等的小分子RNA(tRNA、核内小分子RNA等） 1~5% ——mRNA RNA是分子生物学研究的重要组成部分 cDNA文库的构建 RNA序列分析 RT-PCR Northern Blotting 蛋白质的体外翻译 总RNA提取纯化的方法和原理 常用总RNA分离方法: 酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC) 异硫氰酸胍 ——是已知作用最强的蛋白变性剂，在裂解细胞释放RNA的同时能迅速使RNA酶失活（酸性环境有利于其活性的发挥，能最大限度地发挥其对RNA酶的抑制作用） 十二烷基肌氨酸钠和酚 ——是强的蛋白变性剂，对RNA酶也有一定的抑制作用。 △酸性环境下RNA、蛋白质和DNA分别进入不同的分布相中，RNA进入上层水相，蛋白质进入下层有机相，DNA则进入上下两层界面处的中间层。 氯仿 ——不但有一定的蛋白变性作用，而且能迅速使各相分离，使RNA与其它成分分开。 RNA浓度（μg/ml） =A260nm×40× 1/光径×稀释倍数 RNA得量（μg） =RNA浓度×最终RNA原液毫升数 注意事项 1. 实验器具预处理和配制试剂的注意点: a.经清洗烘干的玻璃器皿，必须在250℃烘烤4小时，不能经受高温烘烤的塑料器具，最好只用一次。 b.实验中要戴一次性手套。 c.RNA抽提中所用的试剂均需用DEPC处理，但含Tris的试剂除外，因DEPC遇Tris迅速分解为乙醇和CO2。 2. 特异性RNase抑制剂的应用 ①钒酰核苷复合物（VRC） 是一种氧化钒离子和四种核苷组成的复合物，可与RNase结合而抑制RNase的活性。常用浓度为10mM。 ②Rnasin 是一种从大鼠肝脏或人胎盘分离得到的分子量为40000的蛋白质，对RNase有抑制作用。 样品中的VRC和Rnasin都可用酚抽提方法去除。 焦碳酸二乙酯DEPC是RNA酶的强烈抑制剂。有致癌之嫌，须小心操作。 (Purification and Isolation of Total RNA) 种类： messager RNA(mRNA) ----携带DNA的编码信息从细胞核到细胞质中，在那儿被用于蛋白质的合成 ribosomal RNA(rRNA) ----核糖体中发现的一种RNA transfer RNA(tRNA) ----携带氨基酸到核糖体中以便它们能被连接在一起合成蛋白质 DEPC配制的75%乙醇 ——洗涤（去除RNA表面的残留的有机溶剂）。 * DNA的种类： 真核生物DNA 细菌DNA 病毒DNA 质粒DNA 95%以上是双链线性分子 形式多样： 单链环状 线状 双链环状 线状 双链环状 提取DNA样品的主要来源： 生物组织 血液 培养细胞 酚-氯仿抽提法（组织DNA） 碱变性法等（质粒DNA）； [实验方法] 提取DNA的总原则： 1、保证核酸一级结构的完整性； 2、排除其它分子的污染。 其它分子的污染: (1) 对酶有抑制作用的物质 有机溶剂、高浓度金属离子 (2)其他生物大分子(降低到最低浓度) 蛋白质、多糖和脂类 (3) 其它核酸的污染 提取DNA时，去除RNA △提取RNA时，去除DNA 尽量减少抽提过程中各种影响因素对核酸的破坏； 实验中的注意事项： 各种因素对核酸的破坏： 物理因素 化学因素