第八章 离子交换层析Ⅱ.pptVIP

第八章 离子交换法 第六节 新型离子交换剂 第七节 应用实例 第八节 离子交换聚集色谱 第七节 新型离子交换树脂 一、大孔、均孔树脂 1.大孔型离子交换树脂（MP） 2.均孔型离子交换树脂 ( IR ) 二、多糖基离子交换剂 1.离子交换纤维素 2.葡聚糖凝胶离子交换剂 大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔吸附剂合成后（加入致孔剂），再引入化学功能基团，便可得到大孔离子交换树脂 特征： 骨架交联度高，较好的化学、物理性能稳定性、机械强度 孔径大、不受环境影响的永久性孔隙，动力学性能好，抗污染能力强，交换速度快，有利大分子交换 表面积大、吸附能力强 孔隙率大、比重小，对小离子的体积交换量比凝胶型树脂小 树脂骨架:纤维素 1）根据活性基团的性质可分: 阳离子交换纤维素 阴离子交换纤维素 ②离子交换纤维素的选择 正电荷----阳离子 负电荷----阴离子 根据等电点和溶液的pH确定带点状态，考虑物质的稳定性和溶解度及交换剂的解离度，选择合适的pH范围 2.葡聚糖凝胶离子交换树脂和琼脂糖凝胶离子交换树脂 骨架:葡聚糖凝胶(sephadex)和琼脂糖凝胶（sepharose) 分阳离子交换和阴离子交换树脂 命名方法： 交换活性基团+原骨架编号 CM-sephadex C-25（羧甲基纤维素） DEAE-sephadex A-25(二乙胺基乙基纤维素） A—阴离子 C —阳离子 特点：除了具有离子交换功能以外、兼有分子筛的功能，提高了分离的效率 思考题 1.多糖基离子交换剂主要分为哪两类 2. CM-sephadex C-25 3. DEAE-sephadex A-25 4.离子交换法有哪些方面的应用 5.色谱聚焦的原理 6.K值为离子交换常数， K＞1说明树脂对交换离子吸引力。 7.由下图，利用给出的两种离子交换剂（E1，E2）分离3种蛋白质（P1、P2、P3），用箭头流程图表示(并指出E1，E2的类型)。 （三）聚焦效应 当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，移动速度明显减慢。 此时加上相同的第二个样品，它将以洗脱液移动的速度下降，直至追到正在慢移的第一个样品（聚焦）。 如果加入的第二个样品的等电点比第一个样品高，它可以越过第一个样品区先被洗脱出来。 * ● 抹香鯨肌紅蛋白 (pI = 8.2) 追過 馬肌紅蛋白 (pI = 7.4) 二、多缓冲剂 多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂，是分子量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合物。 Polybuffer96 PBE94（pH6～9） Polybuffer74 PBE94 （pH4～7） * 三、多缓冲交换剂 PBE94是以交联琼脂糖6B（Sepharose 6B）为载体，并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的多缓冲交换剂，是阴离子交换剂。 当Polybuffer96流进多缓冲交换剂时，PH梯度溶液可以自动形成（9—6）。 * * 四、操作步骤 凝胶柱的准备 （1）凝胶按1∶1悬浮于起始缓冲液中，除气泡。 （2）柱垂直除底部尼龙网下的气泡，关闭柱下端出口。 （3）在柱中放2~3ml起始缓冲液，搅拌下缓缓倒入。 （4）打开柱底部开关，待凝胶沉降后将柱顶部接头装好。 （5）用10~15个柱床体积起始缓冲液平衡。 * * * 大孔型与凝胶型离子交换树脂物理性质 * 一、大孔、均孔树脂 1.大孔型离子交换树脂（MP） 大孔型离子交换树脂主要特性 * 2.均孔型离子交换树脂（IR） 主要是阴离子交换树脂。 骨架的交联度比较均匀。 交联度均匀，孔径大小一致，交换容量都较高，膨胀度、机械强度好。 * 二、多糖基离子交换剂 生物大分子对离子交换的要求: 固相载体具有亲水性和较大的交换空间; 对其生物活性有稳定作用，并便于洗脱。 生物来源稳定的高聚物——多糖作载体。 多糖基离子交换剂可以分为： 离子交换纤维素 葡聚糖离子交换剂 * 1.离子交换纤维素 * 常用的离子交换纤维素 羧甲基纤维素（CM-C）：弱酸性阳离子交换纤维素，pK=3.6 。 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-C）：强碱型阴离子交换纤维素，pK=9.1。 * 2）离子交换纤维素特点： (1)开放的长链骨架，亲水性强，表面积大，易吸附大分子。 (2)交换基团稀疏，对大分子的实际交换容量大。 (3)吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不宜变性。 （4）分辨率高。 * 3）离子交换纤维素的操作 ①操作方式 可静态交换，也可动态交换。 交换基团密度低、吸附力弱。总交换容量低，缓冲盐浓度不宜高（控制在0