高一生物核酸化学2.pptVIP

* * * * * * * * * * 第五节 核酸的某些理化性质及 核酸研究常用技术 一、 核酸的紫外吸收（λmax=260nm） 二、 核酸的变性 三、核酸的复性和分子杂交 四、核酸的沉降性质 核酸具有酸性；粘度大；由于嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键，能吸收紫外光，最大吸收峰为260nm。 故常用紫外分光光度法测定核酸的含量。 一、DNA的紫外吸收 二、DNA的变性 在理化因素作用下，DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变，这种现象称为DNA的变性(denaturation)。 引起DNA变性的因素主要有：①高温，②强酸强碱，③有机溶剂等。 DNA的变性过程 加热 部分双螺旋解开 无规则线团 链内碱基配对 ① 增色效应(hyperchromic effect)：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象； ②粘度降低 ③ 生物学功能丧失或改变。 DNA变性后的性质改变 DNA的紫外吸收光谱 天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值 1 2 3 220 240 260 280 0.1 0.2 0.3 0.4 波长（nm） 光吸收 1 2 3 加热DNA溶液，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，达到其最大值一半时的温度，就是DNA的变性温度（融解温度，melting temperature, Tm）。 DNA的变性温度 Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。 核酸的变性、复性和杂交 变性（加热） 探针 杂交（缓慢冷却） 复性（缓慢冷却） 变性：在物理、化学因素影响下， DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。 复性：在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有A260减小（减色效应）,DNA的功能恢复。 三、DNA的复性与分子杂交 将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间（退火annealing），则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。 将变性DNA经退火处理，使其重新形成双螺旋结构的过程，称为DNA的复性。 两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，这一现象称为核酸的分子杂交(hybridization)。 核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。 不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序(homologous sequence)。 DNA-DNA 杂交双链分子 变性 复性 不同来源的DNA分子 DNA-DNA杂交示意图 DNA-RNA杂交示意图 在核酸杂交分析过程中，常将已知顺序的核酸片段用放射性同位素或生物素进行标记。带有一定标记的已知顺序的核酸片段称为探针（probe）。 利用核酸的分子杂交，可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。 常用的核酸分子杂交技术有：原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。 Southern印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 四、 核酸的沉降性质（sedimentation coefficient） 沉降系数：生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。 沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围，为方便起见，把作为沉降系数的一个单位，用Svedberg单位，用即S表示。 离心机结构示意图 转头 转头腔 沉降样品 驱动马达 真空 冷冻 第六节 核酸酶及人类基因组计划简介 凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶(nuclease)。 凡能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶；凡能从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。 能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶，restriction enzyme）。 * * * * * * * * * *