靶向fgfr1的新型抑制剂的设计筛选及抗肿瘤活性研究药理学专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文 温州医学院硕士学位论文 靶向FGFRl的新型抑制剂的设计、筛选及抗肿瘤活性研究 摘 要 目的 1．以文献报道的FGFR3激酶抑制剂NDGA和本课题组前期工作中发现的新型 FGFRl激酶抑制剂EF24为共同先导物进行药物设计，以期得到高效、特异靶向 FGFRl的小分子抑制剂； 2．对设计的EF24、NDGA类化合物进行FGFRl激酶抑制活性检测，筛选出活 性较好的FGFRl激酶抑制剂；研究活性化合物与ATP的竞争关系；探讨活性化 合物与激酶抑制活性之间的构效关系； 3．研究筛选出的激酶抑制剂对多种肿瘤细胞的增殖抑制活性并探索其初步的作 用机制，筛选出在细胞层面具有较好抗肿瘤活性的抑制剂； 4．研究优选出的体外抗肿瘤活性抑制剂的小鼠体内抗肺癌药效，以期得到高效 低毒的新型FGFRl抑制剂类候选抗肿瘤药物。 方法 1、EF24、NDGA类似物的设计 EF24是一种哌啶酮桥连、分子两端为含氟苯环的单羰基姜黄素类似物。 NDGA(去甲二氢愈创木酸)为两个3，4一二羟基苯环通过4个碳原子的连接链桥 连的对称分子，与EF24的结构具有很大的相似性。以NDAG和EF24为共同先 导物，变换EF24中间连接酮种类为丙酮、环戊酮、环己酮、吡喃酮、噻喃酮和 哌啶酮，也对苯环取代基的种类(以卤素和羟基为主)和位置进行变换，设计出A 类化合物；把EF24分子中间的连接酮改构为吡唑，设计出B类化合物；在保留 NDGA分子两端苯环3，4．二羟基及保留EF24的共轭结构基础上，增加两端苯环 连接碳链的长度设计出C类化合物；改变NDGA分子两端苯环3，4一二羟基为3，4- 二甲氧基设计出D类化合物。共设计以上四个系列共59个化合物。所有化合物 都由吴建章副教授和梁广副教授合成实验室合成、鉴定并提供。 2、用Calipcr Mobility Shift Assay法测定化合物(209M)对FGFRl酪氨酸激酶 活性的抑制率；选出14个活性化合物，测定它们对激酶的半数抑制浓度(IC50)； 再对筛选出的具代表性的活性化合物进行ATP竞争性抑制实验，计算分析酶动 力学参数，判断化合物与ATP的竞争性关系。 3、选择12个高效抑制FGFRl激酶的活性类似物，用western blot检测类似物 (209M)对肿瘤细胞中FGFRl磷酸化的抑制效果；选出抑制活性较好的6个化 合物，用MTT法测定类似物对肿瘤细胞增殖抑制活性的IC50；进一步用westem 温州医学院硕士学位论文blot研究其对bFGF／FGFR促增殖信号分子ERK和AKT的磷酸化水平的抑制作 温州医学院硕士学位论文 blot研究其对bFGF／FGFR促增殖信号分子ERK和AKT的磷酸化水平的抑制作 用；用试剂盒和western blot检测类似物诱导肿瘤细胞促凋亡信号caspase3、 caspase9的表达情况：用流式细胞技术进一步确认化合物促细胞凋亡的效果。 4、优选以上体外抗肿瘤活性较好的6个化合物制成注射液；将NCI-H460细胞 接种到Nu／nu BALB／c裸鼠，构建小鼠荷瘤模型；腹腔注射给药30天，通过测 量肿瘤体积、计算抑瘤率等判断药物的体内抗肿瘤效果。 结果 1、在20pM下，对激酶活性的抑制率达50％和75％以上的化合物分别为26个 和15个：测试的12个化合物对激酶抑制活性的IC50均低于EF24(14}tM)，有4 个化合物的IC50小于5斗M。构效关系显示，与EF24结构相似度很高(2位为卤素 原子，连接酮为哌啶酮)的化合物(A6、A10、A21)，及苯环取代基(3，4一OH) 与NDGA相同的化合物价38、A39、A41、A42)都具有很好的活性；B、C和 D类化合物均无活性。 2、初步鉴定出A41为非ATP竞争性的FGFRl激酶抑制剂。 3、在细胞水平筛选到6个活性化合物(A2、A6、A10、A41、A42、A50)； 它们均对四种肿瘤细胞(SGC7901、H460、A549、U251)的细胞增殖，及胞内 促增殖信号分子FGFRl、AKT、ERK的磷酸化表现出较好的抑制活性；能明显 诱导H460细胞促凋亡信号分子caspase3、caspase9的表达进而诱导细胞凋亡。 4、以上6个化合物均表现出良好的体内抗H460瘤活性，其中A42(3mg／kg／day) 抑瘤率达75％；所有化合物在给药剂量范围及作用时间内，未见明显毒性。 结论 1、EF24、Ⅻ)GA类化合物为一类新型的FGFRt激酶抑制剂；该类化合物分子 两端苯环2位卤素原子及3，4．OH可能是与激酶作用的有效基团；中间连接酮为 哌啶酮时，N—H上氢原子可能与激酶通过氢键作用，能够加强化合物的活性。 2、该类抑制剂可能为非ArP竞争性的酪氨酸激酶抑制剂，但还待于进一步确证； 3、基