磁性纳米微粒介导的表达endostatin的条件复制型腺病毒载体对肝癌的治疗作用研究外科学专业论文.docxVIP

中山大学附属第二医院博士后出站报告 中山大学附属第二医院博士后出站报告 摘要 摘要 目的 构建表达内皮抑素(endostatin)基因的条件复制型腺病毒载体，在体、 内外研究其对肝癌生长的抑制作用、及作用机制以及治疗的有效性、安全性；研 究磁性壳聚糖纳米颗粒对条件复制型腺病毒载体靶向定位及、基因转染、治疗安 全性的作用。 方法 以野生型腺病毒Ad5基因组为模板，利用PCR分别扩增腺病毒基因组Ela、 Elbl9k序列，自pSP—endo-eGFP质粒中切取endostatin--eGFP融合基因，依次 将以上基因序列克隆到腺病毒包装系统中的穿梭质粒pDC316中，然后与腺病毒 骨架质粒pAdeno—x共同转染低传代的293LP细胞中进行病毒包装；包装成功的 病毒利用高传代的293ST细胞进行病毒扩增，然后进行病毒的纯化、鉴定；利用 流式细胞术分析病毒载体在肝癌细胞HepG。和人脐静脉血管内皮细胞HUVEC中的 转染效率；利用RT--PCR、免疫组织化学技术、Western Blot、ELISA技术检测 不同基因载体对目的基因表达的影响；利用PCR技术、腺病毒滴度检测试剂盒以 及透射电镜检测病毒转染后细胞内病毒颗粒的复制；利用MTT试验检测病毒载体 对细胞增殖的影响：利用流式细胞术检测病毒载体对细胞周期及细胞凋亡的影 响；利用划痕试验检测endostatin对血管内皮细胞迁移功能的影响；构建肝癌 的裸鼠移植瘤模型，通过瘤内注射给药，观察肿瘤体积的变化，绘制肿瘤生长曲 线；利用ELISA试剂盒检测试验动物外周血中内皮抑素的表达水平；处死试验动 物后，HE染色观察试验动物肿瘤组织以及其它脏器的病理改变；利用PCR检测 肿瘤组织及其它脏器、组织中病毒的分布情况；利用RT--PCR检测肿瘤组织及其 它脏器、组织中内皮抑素的表达情况；肿瘤组织石蜡切片，利用免疫组织化学染 色检测观测内皮抑素在肿瘤组织中的表达；利用免疫组织化学染色检测肿瘤组织 中肿瘤血管密度；采用乳化交联法制备磁性壳聚糖颗粒；将病毒载体与磁性壳聚 糖颗粒耦联，紫外分光光度计法及腺病毒壳蛋白免疫法检测壳聚糖磁化病毒颗粒 的磁性趋动效应；流式细胞术法检测壳聚糖磁化病毒颗粒的转染效率；w丌法检 Il 中山大学附属第二医院博士后出站报告 中山大学附属第二医院博士后出站报告 摘要 测磁性壳聚糖纳米颗粒对细胞的毒副作用；RT-PCR检测磁性壳聚糖纳米颗粒对 内皮抑素基因表达的影响；构建裸鼠肝癌移植瘤模型，瘤内注射磁性纳米颗粒耦 连的条件复制型腺病毒载体并在肿瘤局部加以磁场诱导，观察病毒在体内的分 布。 结果 成功构建了表达内皮抑素的条件复制型腺病毒载体crAd—endo—eGFP及不含 治疗基因的条件复制型腺病crAd-eGFP，并加以大规模扩增、纯化：利用流式细 胞术分析crAd—endo—eGFP的转染效率明显高于质粒pShuttle—endo—eGFP的转染 效率；RT—PCR、免疫组织化学技术、Western Blot、ELISA均检测到了 crAd-endo-eGFP转染细胞后内皮抑素的表达，其中转染了erAd—endo—eGFP病毒 的HepG2细胞内endostain的表达量明显高于转染了相同拷贝数复制缺陷型腺病 毒载体Ad—endo—e6FP的细胞，而在HUEVC中，两种病毒无明显差别；转染细胞 后，肝癌细胞株HepG2中，crAd-endo-eGFP及crAd-eGFP的病毒拷贝数目明显高 于Ad—endo-eGFP及Ad-eGFP，而在人脐带静脉血管内皮细胞HUEVC中，病毒拷 贝数目并无明显区别；复制型的crAd-endo—eGFP对Hep62细胞的增殖抑制率明 显高于复制缺陷型的Ad-endo-eGFP，而对于HUEVC细胞两者并无明显区别；流 式细胞术检测crAd-endo-eGFP可以使HUVBC细胞周期阻滞在Gl期，并诱导细胞 的凋亡；细胞划痕试验表明crAd—endo—eGFP可以明显抑制血管内皮细胞的迁移 能力；在动物体内，crAd—endo—eGFP可以抑制肿瘤的生长，并进一步缩小肿瘤 体积，并且呈现一定的剂量依赖性，其治疗效果明显好于复制缺陷型的 Ad-endo—eGPP； RT—PCR和免疫组织化学染色均检测到了endostatin在肿瘤组 织中的表达；HE染色crAd—endo-eGFP治疗组肿瘤组织内有明显的坏死灶，其它 脏器组织内无明显改变；PCR检测病毒DNA，发现肿瘤组织内和肝脏组织内存在 腺病毒E2基因，尤以肿瘤组织内为高，其它