家蚕败血病病原拮抗菌的鉴定与抑菌作用.doc

家蚕败血病病原拮抗菌的鉴定与抑菌作 摘要从木论喀斯特森林保护区土壤中分离获得1株对家蚕败血病病原具有 显著拮抗作用的菌株，并研究其对家蚕败血病的抑菌效果，以期为新型微生物农 药的开发奠定基础。拮抗菌株的发酵产物对败血菌具有较强的拮抗作用，抑菌圈 直径平均为22.60 mm ,抗菌发酵液最大稀释倍数可达60倍。根据菌株的形态 特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析对其鉴定为Paenibacillus polymyxa , 命名为 Paenibacillus polymyxa HC2015o 关键词:家蚕；败血病；拮抗菌；抑菌作用 细菌、真菌、病毒分别为家蚕疾病的三大病原。家蚕败血病(Bacterial septicemia )是很严重的细菌病害,目前主要以化学药品防治败血病。大量使 用化学药品易导致环境污染并威胁人体健康，因此采用生物制品取代化学药品是 大势所趋。筛选家蚕病原物拮抗菌对生态蚕业的发展具有重要意义。 目前，拮抗菌研究的重要性已日益凸岀，学者从土壤、水、植物体内筛选分 离拮抗菌菌株，并证实其在生物防治、促进生物健康发育等多个方面具有利用价 值然而，生物防治主要应用于植物病害，关于动物病害防治的研究鲜见 报道。笔者所在课题组从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选岀1株对家蚕败血病 病原具有显著拮抗作用的菌株，且其抑菌谱较广，对金黄色葡萄球菌、家蚕病原 菌败血菌、苏云金芽胞杆菌、黑霉菌、大肠杆菌等多种动植物病原菌均有较强的 拮抗作用。本试验检测了 A-02菌株对家蚕败血病的拮抗作用”以期为新型蚕桑 用微生物农药的开发提供依据。 1材料与方法 1.1材料 家蚕败血菌(Bacterial septicemia )由笔者所在实验室保存z家蚕败血病 菌病原拮抗菌菌株从木论喀斯特森林保护区土壤中筛选获得。 1.2菌悬液制备及分离培养 称取土壤10 g z于灭菌硏钵中硏碎，将100 mL无菌水加入灭菌硏钵，振 荡10 ~ 20 min ,即为10-1的土壤悬液；静置5 ~ 10 min，吸取上清液1 mL , 依次梯度稀释，分别配制10-2、10-3. 10-4. 10-5. 10-6. 10-7. 10七等不 同浓度的稀释液。取0.1 mL悬液均匀涂布于培养皿中，待表面干燥后，于28 °C 恒温培养箱中倒置培养4~5d,根据菌落的大小、形状、边缘形状、表面结构、 光泽、透明度、颜色等微生物菌落特征挑出单菌落并编号。 1.3拮抗性能的检测 采用平板对峙法检测菌株拮抗，设置3个重复，于28 °C下培养45 de依 据病原菌与拮抗菌之间的距离判断拮抗作用大小，保留拮抗效果优良的菌株。 采用平板扩散法检测发酵液活性,利用PDA液体培养基，于28弋下培养 16 ~ 24 h ,记录发酵液扩散形成抑菌圈的最大稀释倍数。筛选拮抗效果和发酵 性能优良的菌株。 1.4菌体形态特征及生理生化指标的测定 菌体形态及最适pH值测定、过氧化氢酶试验、甲基红试验、氧化酶试验、 腺酶试验、D引瞰式验测试、淀粉水解、V.P试验及葡萄糖、蔗糖、山梨醇、木糖、 甘露醇发酵试验均参照相关文献中的方法⑷进行。 1.516S rDNA序列测定及其系统进化树的构建 16S rDNA序列PCR测走以通用的27F 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3. 1492R 5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3, 为引物，以提取的总DNA为模板。PCR技术扩增16S rDNA序列的反应程序 为：94 °C变性 5 min ; 94 °C 45 s , 56 °C 45 s , 72 °C 90 s z 30 个循环; 72艾延伸10 min f4艾保存。扩增出16S rDNA后，采用1%琼脂糖凝胶电 泳进行分离，经DNA胶回收试剂盒纯化后，直接邮寄至上海生工生物工程技术 服务有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对分析，并筛选岀9株菌 株16S rDNA的全序列，采用ClustalW软件构建系统进化树。 2结果与分析 2丄菌株的分离筛选 □□经拮抗性能检测筛选到1株对家蚕病原菌（金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大 肠杆菌）均有较强拮抗作用的菌株，编号为A-02o该菌株对败血病菌的抑制效 果较强，抑菌圈直径平均为22.60 mm ,抗菌发酵液最大稀释倍数可达到60倍 □□ □□（图1）。由表1可知，A-02菌株及其发酵液对败血病菌、苏云金杆菌的拮抗 作用最强，对金黄色葡萄球菌、黑霉菌、大肠杆菌也有一定拮抗作用;发酵液稀 释40?60倍时对上述病原菌的拮抗作用仍明显，可见该菌株的发酵性能良好。 □□ 2.2拮抗菌培养形态特征及革兰氏染色结果 A-02菌株在PDA培养平板上生长的菌落特征为乳白色菌落、有光泽、菌 落光滑、半透明。A-02菌株革兰氏染色为阳性；芽胞为