粉花石斛的arms鉴别及ssr标记的开发植物学专业论文.docxVIP

学位论文独创性声明本人郑重声明： 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1、坚持以搿求实、创新一的科学精神从事研究工作． 2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果。 3、本论文中除引文外．所有实验、数据和有关材料均是真实 的。 4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机 构已经发表或撰写过的研究成果。 5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表 示了谢意。 作者签名：鑫耋 日 期；玉谚≥：鄂： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：垒杰 日 期：盘!鳘：垒丝：． 粉花石斛的ARMS鉴别及SSR标记的开发 粉花石斛的ARMS鉴别及SSR标记的开发 摘要 鉴于粉花石斛在药用时存在许多同属相似种，本论文运用扩增阻碍突变系统 (ARMS)技术对粉花石斛及其同属相似种进行了分子鉴别，并初步进行了粉花石 斛SSR标记的开发。研究结果总结如下： 运用Clustal X 1．8、MEGA 3．1等软件对粉花石斛及其相似种的rDNA ITS 序列进行比对分析。据粉花石斛的两个特异性位点，运用DNAMAN软件根据引 物设计原则设计了l对位点特异性鉴别引物(AS．PCR)。在AS．PCR引物的基础 上，从引物3’端的第2个位点至第6个位点引物的核酸序列分别进行突变，突变 方法采用突变位点用A和C互换，G和T互换。(T／A碱基对被T／C碱基对替 换，C／G碱基对被C／T碱基对替换)，设计出5对ARMS鉴别引物。鉴别结果表 明：运用位点特异性鉴别引物(FJB．01．forward和FJB．01．reverse)对粉花石斛进 行鉴别时，退火温度低于640C时，实验结果不稳定。只有当退火温度在“oC 至650C时，位点特异性鉴别引物才能稳定地对粉花石斛进行鉴别。而在用5对 ARMS引物进行鉴别时，发现只有2对引物(F旧一04．forward，FJB．04一reverse)和 (FJB．03．forward，FJB．03-reverse)fl龟够稳定、高效地进行粉花石斛鉴别。其中，一 对引物(FJB．04．forward。FJB．04-reverse) 能在480C至620C比较宽的退火温度 范围内进行鉴别。另一对引物(FJB．03．forward，FJB一03-reverse)也能在490C至 550C的温度范围内对粉花石斛进行鉴别，而其它3对ARMS引物对粉花石斛的 鉴别效果不佳。 粉花石斛微卫星(SSR)标记的开发采用的是磁珠富集法，具体的开发流程 是：首先使用QIAGEN法提取到完整的粉花石斛总基因组DNA；随后进行酶切， 琼脂糖凝胶检测，选取200．900 bp条带进行切胶，纯化：根据酶切位点设计接头， 加接头进行连接，根据接头的序列设计引物对纯化产物进行PCR扩增，产物纯 化后用含(AC)8和(AC)15的两种探针进行杂交，将磁珠富集杂交的片段用2xSSC， 0．1％SDS和lxSSC，0．1％SDS分别清洗3次，得到富含微卫星的序列。经PCR 扩增、纯化、克隆及菌落PCR检测后，选取琼脂糖凝胶电泳上能在200．900 bp 摘要范围内扩增出条带的菌液送公司测序，最终测出富含微卫星的序列。本实验共成 摘要 范围内扩增出条带的菌液送公司测序，最终测出富含微卫星的序列。本实验共成 功筛选出9条富含微卫星的序列，每条序列中的微卫星重复单元均超过7次，重 复序列分别为AG单元、TG单元、AC单元、CA单元、GT单元、TC单元和 GA单元。在此基础上设计的9对粉花石斛SSR引物，将为今后进一步分析粉花 石斛的遗传多样性和遗传结构、寻找粉花石斛道地性药材等方面的研究奠定基 础。 关键词：粉花石斛；rDNAITS区；AI洲S；分子鉴别；SSR：开发 2 AbstraetThe Abstraet The research of Dendrobium loddigesii Rofle by Amplification Refractory Mutation System(ARMS)and Simple Sequence Repeat(SSR) Abstract In this paper,Amplification Refractory Mutation System(ARMS)were employed for the authentication of Dendrobium loddigesii