蛋白质组学研究相关技术的发展及其在大鼠海马细胞膜蛋白质组研究中的应用生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中英文摘要摘 中英文摘要 摘 要 蛋白质组学研究主要依赖三大技术：蛋白质组分离技术、蛋白 质组鉴定技术以及利用生物信息学对鉴定的蛋白质进行结构和功能 分析与预测。蛋白质组学的发展既为技术所推动也受技术所限制，蛋 白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低， 因此发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台即蛋白质组学 方法学研究是当今乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任 务之一。本文在蛋白质组学方法学研究方面进行了一系列探索，首先 建立并优化了肽质量指纹图(PMF)分析方法；在此基础上对MALDI—TOF 源后衰变(PSD)从头测序(de 170VO sequencing)方法进行了探索， 在比较了化学辅助磺酸化修饰试剂3一磺酸丙酸N一羟基琥珀酰胺酯 后，提出了一种新型的化学辅助磺酸化修饰试剂磺基异硫氰酸苯酯 (SPITC)，对包括缓冲液、盐浓度、反应温度和时间在内的各种衍生 条件进行了摸索与优化，并将该方法成功地运用于中药复方861对肝 星状细胞影响的蛋白质组学研究以及HT一1080人纤维肉瘤细胞的蛋 白质组学研究中，对2 D一胶分离的肝星状细胞蛋白质点以及lD一胶分 离的人纤维肉瘤细胞蛋白质条带的酶解肽片段进行了序列测定，得到 了可靠的结果。该磺酸异硫氰酸苯酯(SPITC)辅助的de 170vo sequencing方法具有测定成本低廉、操作简单易行、结果准确可信 的优点；与传统的串联质谱MS／MS测序方法相比较，该方法得到的图 谱只包含简单的y+离子系列，背景干净、信躁比高，极大地解决了 质谱幽170VO测序中图谱复杂、解析困难的难题；结合PMF方法，能 准确地鉴定来自2D胶的蛋白质点，甚至对于1D—PAGE分离的混合蛋 白质点也能毫不含糊地鉴定。该方法在蛋白质组学上的发展和应用将 极大地提高蛋白质鉴定的准确度和可靠性。此外，还对MALDI—TOF质 谱结合羧肽酶Y消化进行蛋白质和多肽c端如novc sequencing方 法进行了摸索和优化，采用对不同浓度和不同时间间隔混合样品取样 的方法，通过测定消化后肽片段所形成的梯度式分子量，得到了一次 测定c端20个氨基酸序列的结果。在此基础上，对磷酸化肽的分离 及鉴定也进行了初步研究，采用MALDI—TOF结合磺基异硫氰酸苯酯 (SPITC)辅助的从头测序方法，将用固相金属离子亲和色谱柱 III 中英文摘要(IM$C)选择性地从混合物中亲和提取的磷酸肽进行磷酸化位点鉴 中英文摘要 (IM$C)选择性地从混合物中亲和提取的磷酸肽进行磷酸化位点鉴 定获得成功；该方法可以不需要进行磷酸酶水解以及进行放射性标 记来确定混合物中的磷酸肽，在进行磷酸化位点分析时，只有带有 正电荷的Y+离子系列出现在质谱图中，使得谱图解析变得非常容 易，甚至可以不需借助于任何软件，只需简单地计算增加80道尔顿 的磷酸化氨基酸，即可极其容易地鉴定多磷酸化修饰肽片段的多个 磷酸化位点；该方法的使用将极大地提高磷酸化蛋白质或多肽鉴定 的准确性及其通量水平。 海马(hippocampus)是大脑颞叶内侧的一个脑结构，是哺乳动物 学习和记忆的重要结构区。但纵观海马与记忆的研究领域，无论国内 国外都没有研究者涉足海马细胞膜的蛋白质组学研究领域。膜蛋白占 人类整个基因组编码蛋白质的近三分之一，在细胞生命活动中发挥着 重要作用。基于蛋白质整体水平上的海马质膜蛋白质组研究将有助于 阐明海马的神经生物学功能并有可能发现+些新的受体与通道蛋白 以及药物靶标。 本研究从大鼠海马细胞膜的富集，膜蛋白的分离鉴定等几个方面 进行了细胞质膜的蛋白质组学研究，采用了不同的分离鉴定技术路 线，包括传统的2DE分离结合LC／Q～ToF方法，以及1D—SDS—PAGE分 离结合LC／Q—TOF，1D—SDS—PAGE分离结合MALDI～TOF／TOF方法，分别 对人鼠海马组织匀浆提取的质膜蛋白以及急性分离培养的海马细胞 提取的质膜蛋白质进行了鉴定：建立了细胞质膜的生物素亲和纯化方 法，该方法用包裹了链霉亲和素的磁珠纯化标记了生物素的质膜片 段，然后使用磁分离器收集磁珠得到纯的质膜部分，再采用高盐高 pII溶液洗涤质膜，实验结果显示该方法提取的膜蛋白具有高含量的 质膜特异性蛋白Na+／K+ATPase及Caveol in，且不舍有胞质特异性 蛋白actin，表明该方法能成功地富集膜蛋白，并能除去质膜蛋白鉴 定中最大的污染蛋白——与质膜最紧密相连的胞质骨架蛋白的影响。 通过对大鼠海马细胞质膜的蛋白质组学研究，探索了 条适合于生物 膜蛋白的蛋白质组学研究方法。在用生物素亲和纯化质膜提取的海马 细胞质膜蛋白质组中，明确鉴定了118种蛋白质，其中定位在膜上的 蟹FI质有74个，占62．7％，表明该方法完全适合于膜蛋白质的分析 V 中