抗HIF1α和survivin基因双靶位miRRNAi载体的构建及其对胰腺癌.PDF

第４１卷　第１期 浙 江 大 学 学报 （医学 版 ） Ｖｏｌ４１　Ｎｏ１ 　 ２０１２年 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＺＨＥＪＩＡＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＭＥＤＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ） 　 ２０１２ ｈｔｔｐ： ｗｗｗ．ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｍｅｄ ＤＯＩ：１０．３７８５／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８９２９２．２０１２．０１．０１４ ∥ 抗 ＨＩＦ１ 和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因双靶位ｍｉＲＲＮＡｉ载体的 α 构建及其对胰腺癌细胞的作用 徐孙兵，朱一平，牟一平，朱玲华 （浙江大学医学院附属邵逸夫医院普外科，浙江杭州３１００１６） ［摘　要］　 目的：构建抗 ＨＩＦ１ 单靶位（ａｎｔｉＨ）、抗 Ｓｕｒｖｉｖｉｎ单靶位（ａｎｔｉＳ）以及抗 ＨＩＦ１ 和 α α Ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因双靶位微小ＲＮＡ表达载体（ａｎｔｉＨ＋Ｓ），观察和比较这３种载体对胰腺癌Ｐａｎｃ１细胞 增殖的影响。方法：设计４组靶向ＨＩＦ１ 和 Ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因的寡核苷酸序列，连接至 ｐｃＤＮＡ６．２ α ＧＷ／ＥｍＧＦＰｍｉＲ质粒，构建两组共８个载体，依次为ａｎｔｉＨ（ ）、ａｎｔｉＨ（ ）、ａｎｔｉＨ（ ）、ａｎｔｉＨ Ⅰ Ⅱ Ⅲ （ ）和ａｎｔｉＳ（ ）、ａｎｔｉＳ（ ）、ａｎｔｉＳ（ ）、ａｎｔｉＳ（ ）。实时定量ＲＴＰＣＲ检测靶基因ｍＲＮＡ的表 Ⅳ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 达水平，将两组中ｍＲＮＡ下调作用最强的质粒串联，构建ａｎｔｉＨ＋Ｓ。用ａｎｔｉＨ＋Ｓ及 ｍＲＮＡ下调 作用最强的ａｎｔｉＨ和ａｎｔｉＳ转染胰腺癌Ｐａｎｃ１细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定靶蛋白表达情况，ＭＴＴ法检 测细胞增殖活性。结果：经测序鉴定，所有ａｎｔｉＨ、ａｎｔｉＳ及双靶位质粒ａｎｔｉＨ＋Ｓ装载位点核苷酸 序列与设计序列完全相符。ａｎｔｉＨ的靶基因ｍＲＮＡ沉默效率依次为４８％、２％、４４％和３０％；ａｎｔｉＳ 的靶基因ｍＲＮＡ沉默效率依次为７２％、７５％、５８％和５９％。由ａｎｔｉＨ（ ）和ａｎｔｉＳ（ ）串联得到 Ⅰ Ⅱ 双靶位质粒ａｎｔｉＨ＋Ｓ。ａｎｔｉＨ＋Ｓ的靶基因ｍＲＮＡ沉默效率为５３％（ＨＩＦ１）和４２％（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）。 α ａｎｔｉＨ（ ）、ａｎｔｉＳ（ ）及ａｎｔｉＨ＋Ｓ与对照质粒相比均使靶基因蛋白的表达明显下降，细胞增殖受 Ⅰ Ⅱ 到明显抑制（Ｐ＜０．０５）。其中ａｎｔｉＨ＋Ｓ对细胞的增殖抑制作用强于ａｎｔｉＨ（ ）和ａｎｔｉＳ（ ），７２ Ⅰ Ⅱ ｈ后差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论：本研究成功构建了抗ＨＩＦ１ 和Ｓｕｒｖｉｖｉｎ的单靶位质粒 α 和双靶位质粒；其中，ａｎｔｉＨ＋Ｓ抑制胰腺癌Ｐａｎｃ１细胞增殖作用强于ａｎｔｉＨ（ ）和ａｎｔｉＳ（ ）。 Ⅰ Ⅱ ［关键词］　胰腺肿瘤／遗传学；微管相关蛋白质类／遗传学；缺氧诱导因子 １／遗传学；基因表达； 遗传载体；质粒／遗传学；转染；肿瘤细胞，培养的；ＲＮＡ