成年豚鼠全卵巢程序化冷冻法与快速冷冻法的比较研究妇产科学生殖内分泌专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文成年豚鼠全卵巢程序化冷冻法与快速冷冻法的比较研究 温州医学院硕士学位论文 成年豚鼠全卵巢程序化冷冻法与快速冷冻法的比较研究 中文摘要 目的 比较程序化冷冻法和快冻冷冻法对豚鼠全卵巢卵泡存活率和颗粒细胞凋亡的影 响。 方法 1．带血管蒂豚鼠全卵巢动脉灌注模型的建立：利用自行设计的微血管灌注装置 (专利号ZL201120059359．8)，将明胶墨汁经卵巢动脉灌注豚鼠全卵巢，直 至卵巢全部变黑，4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片，苏木精一伊红(HE) 染色，观察墨汁在卵巢脉管系统中的分布。 2．两种冷冻保护液对豚鼠全卵巢的毒性测试：采用微血管灌注装置通过卵巢动 脉将慢冻或快冻冷冻保护液以lmL／min速率灌注豚鼠全卵巢，不进行冷冻， 而采用相应的解冻液以同样速率灌注卵巢，之后采用酶法结合机械法分离窦 前卵泡，台盼蓝对卵泡进行活力测试。 3．两种冷冻方法保存豚鼠全卵巢效果的比较：采用微血管灌注装置通过卵巢动 脉将慢冻或快冻冷冻保护液以lmL／min速率灌注豚鼠全卵巢后，采用相应的 方法冷冻，液氮保存7天以上，然后采用相应的解冻液以同样速率灌注卵巢， 随之将解冻后半数卵巢置于酶解液中分离出其中的窦前卵泡，采用台盼蓝对 卵泡进行活力测试。另外半数解冻卵巢投入4％多聚甲醛固定，包埋、切片 及HE染色，观察卵泡形态及血管结构以评估冻融损伤；TUNEL检测卵巢 组织在冻融过程中产生的DNA断裂片段。 结果 1．豚鼠全卵巢动脉灌注模型的建立 墨汁作为灌注液进入卵巢血管的示踪物质，明胶则作为墨汁的承载介质。灌 注豚鼠全卵巢，组织学切片见墨汁出现在卵巢内排卵前卵泡膜细胞层周围微 血管腔内，同时也出现在窦卵泡、窦前卵泡周围的血管内。髓质血管丰富， 可见大量墨汁分布。证实豚鼠全卵巢动脉灌注模型已成功建立。 2．卵泡分离及台盼蓝活力染色检测两种冷冻保护液和两种冷冻方法对豚鼠全 卵巢卵泡的毒性作用 采用酶法结合机械法分离豚鼠全卵巢获得窦前卵泡，每卵巢平均数分别为： 温州医学院硕士学位论文慢冻液灌注组26．67 温州医学院硕士学位论文 慢冻液灌注组26．67 4-3．84、快冻液灌注组40．00 4-6．1 1，两组比较差别无统 计学意义(PO．05)，分别与新鲜组(36．7±6．6)比较，同样无显著性差异 (PO．05)。慢冻组和快冻组分离获得的卵泡数分别为16．00士7．3 1，9．67士0．88， 慢冻组分得卵泡多于快冻组(PO．05)。与非冻融组(新鲜对照和灌注对照 组)全卵巢相比，两冷冻组平均每个卵巢分离获得窦前卵泡数明显减少(P O．05)。 分离获得的窦前卵泡经台盼蓝活力染色，少于2个及2个颗粒细胞着色，同 时其他颗粒细胞和卵母细胞不着色，则认为健康的卵泡。多于2个颗粒细胞 着色和／或卵母细胞着色，则认为卵泡已损伤。慢冻液灌注组卵泡受损率为 14．5％，灌注快冻液组则为13．3％受损，两组比较无显著性差异(PO．05)， 新鲜组卵泡受损率略低(12．2％)，但与两灌注组比较无显著性差异(P 0．05)。慢冻组29％卵泡及快冻组58％卵泡为受损卵泡，慢冻组受损率低于 快冻组(P0．05)。慢冻组与快冻组卵泡受损率均高于新鲜组(P0．05)， 同时也高于灌注组(P0．05)。 3．光镜组织形态学观察结果 豚鼠全卵巢组织原始卵泡形态结构：根据HE染色，冻融卵巢中有保存完好 的原始卵泡和受损的原始卵泡。在受损原始卵泡中，最常见的损伤表现为卵 胞浆缺失或胞浆不规则形态改变。正常原始卵泡百分比，新鲜组为 93．06士4．17％、慢冻组78．95士2．05％，快冻组54．68士8．52％，冻融组卵巢中正 常形态卵泡百分比较新鲜组低，且快冻组低于慢冻组(PO．05)。 豚鼠全卵巢脉管系统形态结构：在所有冻融组中，卵巢动脉插管处，组织学 检查发现动脉内皮层脱落、动脉内弹性膜脱落。在灌注对照组动脉插管处也 发现了同样的损伤改变。然而，卵巢动脉近卵巢门部血管网以及卵巢内微血 管结构保存较完好，未见血管内皮脱落损害。各组静脉形态未见异常。 4．TUNEL检测结果 与新鲜对照组相比，两冻融组卵巢中TUNEL阳性着色率明显提高，阳性染 色主要定位于窦卵泡中的颗粒细胞和膜细胞，而较少出现在髓质部位。新鲜 组织中罕见窦卵泡颗粒细胞染色，阳性对照见原始卵泡等各级发育卵泡染 色，阴性对照无阳性染色。 结论 1．采用自行设计的微血管灌注装置(专利号ZL 201120059359．8)经卵巢动脉 灌注墨汁明胶混合液，固定切片HE染色证实带血管蒂豚鼠全卵巢动脉灌注 模型成功建立，将其应用于豚鼠全卵巢灌注冷冻保护剂行冷冻保存是可行 的。 温州医学院硕士学位论文2．卵巢卵泡分离活力测试提示，与新鲜组相比，豚鼠全卵巢冷冻保护液灌注渗 温州医学院硕士学位论文 2．卵巢卵泡分