toll样受体4在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义口腔临床医学专业论文.docxVIP

Toll样受体4在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义 Toll样受体4在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义 中山大学博士学位论文 目的：研究人正常牙髓组织和成牙本质细胞中TLR4表达与分布特点，探讨TLR4 在牙髓组织天然免疫防御中的可能作用。 方法：从新鲜拔除的人健康第三磨牙获取牙髓组织和成牙本质细胞，扫描电镜观 察牙髓摘除后髓腔壁成牙本质细胞形态和附着情况；RT—PCR检测人牙髓组织以 及成牙本质细胞中TLR4mRNA的表达情况；采用免疫组织化学技术和免疫印迹 方法检测TLR4蛋白的表达与定位。 结果：扫描电镜观察牙髓摘除后成牙本质细胞大部存留在髓室壁上，细胞形态良 好；RT．PCR结果发现正常牙髓组织、成牙本质细胞均可表达TLR4mRNA，产 物大小为278bp；免疫印迹法检测正常牙髓、成牙本质细胞在89kDa附近出现蛋 白条带；免疫组化显示正常牙髓组织中的成牙本质细胞、血管内皮细胞TLR4免 疫反应阳性。正常牙髓中牙髓成纤维细胞不表达TLR4。结论成牙本质细胞通 过表达TLR4参与牙髓牙本质复合体的先天免疫反应，TLR4在牙髓抵御外来病 原微生物入侵的宿主免疫防御中起重要作用。 第二章Toll样受体4在人炎症牙髓组织和大鼠牙髓损伤修复模型中的表达 目的：研究TLR4在人炎症牙髓组织以及大鼠牙髓损伤修复模型中的分布及表达 情况，了解TLR4与牙髓炎症发生以及炎症损伤修复的关系。 方法：收集人炎症牙髓组织标本，采用免疫组织化学技术对TLR4的表达进行定 位，同时利用免疫印迹杂交的方法对蛋白表达水平进行半定量分析。利用髓腔单 纯开放法建立大鼠牙髓损伤修复模型，通过组织病理学检查观察牙髓炎症发生与 转归的整个过程，利用免疫组化技术定位TLR4阳性细胞。 结果：western blotting结果显示人炎症牙髓组织TLR4的相对表达量是正常牙髓 组织的两倍左右，经student t检验，两者有显著性差异(pO．05)，免疫组化结果 发现正常情况下不表达TLR4的牙髓成纤维细胞也有TLR4的表达。利用髓腔单 纯开放法成功建立了大鼠牙髓损伤与修复模型，观察到28d左右有修复性牙本质 桥形成。免疫组化检测观察到TLR4阳性的成牙本质细胞样细胞向成牙本质细胞 受损处迁移并形成第三期牙本质。 结论：炎症牙髓TLR4表达上调，TLR4参与了牙髓组织炎症发生以及损伤修复 的过程。 第三章Toll样受体4在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的表达 Toll样受体4在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义 Toll样受体4在牙髓组织和成牙本质细胞中的表达和意义 中山大学博士学位论文 目的：建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系，研究TLR4在体外培养的牙髓细 胞向成牙本质细胞分化过程中的表达情况，对体内研究结果进行验证。 方法：利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定，使用矿化诱导液诱导牙髓 细胞向成牙本质细胞样细胞分化。观察细胞形态改变和碱性磷酸酶活性变化，用 Von kossa染色法观察诱导后的细胞形成矿化结节的能力，对细胞增殖情况使用 流式细胞仪进行细胞周期测定。以免疫荧光FITC法观察TLR4在诱导分化后的 细胞中的表达，采用RT-PCR检测与成牙本质细胞分化相关基因以及TLR4基因 在诱导分化过程中的表达情况，同时用western blotting方法检测诱导过程中 TLR4蛋白表达情况。 结果：获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性，角蛋白阴性，证明为中胚层来源的 细胞。诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期；3周左右开始有细胞结 节形成，周围细胞呈放射状排列，部分细胞出现细长突起并呈极性排列。4周左 右细胞团中央Von Kossa染色为阳性。免疫荧光法FITC检测诱导3周后的细胞 可见TLR4表达阳性。细胞周期的检测结果表明诱导分化后细胞增殖变慢，多数 细胞处于GoGl期。与未诱导的细胞相比，矿化诱导开始3周碱性磷酸酶活性逐 渐升高，但到第四周后活性有所降低，经统计学分析有显著性差异。矿化液诱导 组细胞RT-PCR产物凝胶电泳可见诱导细胞和未经诱导的对照细胞在整个诱导分 化过程均可表达OCN、I型胶原(COL一1)。未诱导细胞未见TLR4、DSPP、NESTIN 扩增产物条带，诱导3周和4周后TLR4、DSPP、NESTIN明显表达。TLR4蛋 白表达与基因表达情况基本一致，在矿化诱导3周后开始表达，4周时表达增强。 结论：建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系，所获得的成牙本质细胞样细胞 具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能，是研究成牙本质细胞的较好模型。 TLR4蛋白和mRNA在体外诱导分化的成牙本质细胞样细胞均有表达。 第四章LPS对成牙本