常用实验动物与人肠道口腔生殖道微生物组比较动物学专业论文.docxVIP

硕士学位论文低廉的优点，能够显著改善传统微生物研究方法的不足，获得比较理想的微生 硕士学位论文 低廉的优点，能够显著改善传统微生物研究方法的不足，获得比较理想的微生 物群落数据，为我们研究微生物生态学奠定了良好的方法学基础，使得我们能 够更进一步了解微生物的结构与特征。 研究目的 采用基于细菌16S rRNA高通量测序法，研究几种常用实验动物(西藏小型 猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠)的菌群结构以及它们各自的特 点和差异性，并和正常人的数据进行比对分析，初步讨论常用实验动物与人有 关菌群的差异和相似性，以此为人体微生态方面的医学研究提供基础性资料， 并为在选择研究微生态使用的实验动物模型时提供一些参考。 研究方法 第一章肠道菌群样品采集及数据分析 采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、南方医科大学实 验动物中心比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wiser大鼠新鲜粪便，收集于EP管 中，每个品种4只(成年)，雄性1只，雌性3只；共20个样品，．20。C保存。人 的肠道菌群数据由南方医科大学公共卫生与热带医学学院提供。 经粪便样品基因组DNA提取后，用细菌16S rRNA通用引物，PCR扩增样 品的16S rRNA V4区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行 PEl00-bp测序后，得到高通量下的原始数据序列，高通量测序数据用BIPES (Barcoded Illumina Paired·end(PE)Sequencing)流程进行初步原始序列处理，采用 分阶段聚类算法Two-Stage-Clustering(TSC)将干净序列聚类成操作分类单元 (Operational Taxonomic Units，OTUs)， OTU聚类过程中主要采用三种距离法： 最远距离法、最近距离法、平均距离法。对于获得的OTUs，使用GAST(Global Alignment for Sequence Taxonomic)算法对其进行分类。用Mothur方法获得样品 的cc多样性分析(Shannon index，PD whole tree，Observed OTU，Chaol，ACE)， 即单个样品包含种属数量的多少：基于Unifrac距离，采用QIIME进行主成分分 析，分析13多样性，即不同样品之间菌群结构的比较；采用线性判别式分析效 111 万方数据 摘要应值(Linear 摘要 应值(Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe)，Galaxy89在线工具寻找不 同组别之间有统计学差异的菌群标志物(即Biomarker)，LEfSe分析首先采用 Kruskal．Wallis秩和检验检测组间丰度差异显著的种属，然后用成组的Wilcoxon 秩和检验对差异显著的物种种属进行组间差异分析，最后用LDA对数据进行降 维，评估差异显著种属的影响力(即LDA score)。应用IBM SPSS Statistics 20 软件进行统计分析，基于符合正态分布的数据，采用One．Way ANOVA进行 Bonferroni法两两比较分析，校正检验水准；基于不符合正态分布的数据，采用 Kruskal—Wallis One-way ANOVA进行两两比较，校正检验水准。采用GraphPad prism5软件工具对PD whole tree、Shannon等作图。 第二章口腔菌群样本采集及数据分析 用一次性棉拭子采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、 南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠新鲜口腔 菌群样品，每个品种4只(成年)，雄性1只，雌性3只；共20个样品，．20。C保 存。人的口腔菌群数据由南方医科大学公共卫生与热带医学学院提供。经过细 菌总DNA提取后，用细菌16S rRNA通用引物，PCR扩增样品的16S rRNAV4 区。将PCR终产物经过lllumina Hiseq 2000平台进行PEl00．bp测序后，得到 高通量下的原始数据序列，数据的处理方法与第一章相同。 第三章生殖道样本采集及数据分析 用一次性棉拭子采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、 南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴生殖道菌群样品，每个品种3只(成 年)，．20℃保存。人的生殖道菌群数据由南方医科大学公共卫生与热带医学学 院提供。经过细菌总DNA提取后，用细菌16S rRNA通用引物，PCR扩增样品 的16S rRNAV4区。将PCR终产物经过IlluminaHiseq 2000平台进行PEl00．bp 测序后，得到高通量下的原始数据序列，数据的处理方法与第一章相同。 研究结果 第一章肠道菌群