蓝藻蛋白的分离与纯化.docVIP

. .. 藻蓝蛋白的分离与纯化一、 实验目的和要求 1、 了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白一般的提取和 纯化的方法； 2、 掌握蛋白含量测定方法； 掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的实验技术。 二、 实验原理 藻蓝蛋白（PC）是一类普通存在于蓝藻细胞中的光合辅助色素，也是一种天然色素蛋白，具有水溶性，可用作食品着色剂。 此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是 一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗 价值，不但能提高机体细胞的非特异性免疫功能，而且对特异性 免疫功能有促进作用。另外，它还具有清除自由基的能力，可以 抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。 利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成 的正负离子ＮＨ可吸引水分子， 从而夺取蛋白质分子上的水化膜， 还可中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质 的目的。由于各种蛋白质颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度 不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各 不相同研究表明可用 25%(NH4)2SO4 饱和度沉淀除去杂质， 55%(NH4)2SO4 沉淀藻蓝蛋白。 盐析出来的蛋白质， 需通过脱盐以 除去硫酸铵等盐类物质。最常用的脱盐方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，而小分子物质可以自由透过半透 膜，顾不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂质透析掉。 蛋白含量的测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、 考马斯亮蓝法等） 本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的 ， 含量，考马斯亮蓝 G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质 通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由 465nm 变为 595nm，在 一定范围内，蛋白质的含量与 595nm 处吸光值成正比。 离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性 的羧甲基纤维素（CM-纤维素） ，阴离子交换剂有弱酸性的二乙氨 基乙基纤维素（DEAE-纤维素） 。蛋白质的混合物与纤维素离子交 换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相 反电荷基团的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变 PH 或离子强度来实现， 与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层 析柱中被洗脱下来。 本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋 白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的 含量，然后使用 DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯 化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电 点尚无一致结论，但都在 3.4-4.8 之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白 的等电点为 4.3，在 PH6.5 磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择 DEAE-纤维素阴离子交换柱） 。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。 三、 试剂与仪器 1、 试剂 螺旋藻藻粉 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PH6.5） 、标准蛋白（0.1mg/L） 、考马斯亮 蓝 G-250、0.5mol/LNaOH、0.5mol/LHCl、NaCl、0.5mol/LHCl、NaCl、 硫酸铵、透析袋、DEAE 纤维素、奈氏试剂 四、实验步骤 （一） 、藻蓝蛋白的提取及初步纯化 1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋 白。 具体操作：取螺旋藻粉 1g，加入 0.01mol/LPH6.5 的磷酸盐缓冲液 10mL，充分搅拌混匀。室温浸泡 30min-1h 后，在-20℃和 38℃之间 反复冻融数次（3-5 次） 。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入 10mL0.01moL/L PH6.5 的磷酸盐缓冲液， 混匀， 静止 30min， 4000r/min 离 心 20min ， 上 清 液 即 为 抽 提 得 到 的 藻 蓝 蛋 白 混 合 液 。 2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。 具体操作：取上清液，用 25%饱和度的硫酸铵 4℃ 盐析 30min ，然 后 4000r/min 离心 20min，所得上清液用 55%饱和度的硫酸铵放入冰 箱盐析 30min，4000r/min 离心 20min，弃去上清液，离心收集得到 沉 淀 即 为 藻 蓝 蛋 白 。 3、透析去盐 得到的沉淀用 10mL0.01moL/Mlph6.5 的磷酸盐缓冲液溶解，然后 将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为 10Kd）中在蒸馏水中透析以去除盐离子。每隔 1h 换一次透析液，换 3-4 次。 (二)藻蓝蛋白含量测定 1、制作标准曲线； 2、样品含量测定； 3、计算结果。 具体操作步骤如下： 取洁净干燥的试管若干，按表 1-1 比例配置标准蛋白溶液。原本标准 蛋白的浓度为 0.1mg/mL。 表 1-