基因重组和基因工程.pptVIP

二、重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的获取（分） 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章) 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T （二）克隆载体的选择和构建（选） 目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接（接） 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 粘性末端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 平端连接 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 适用于： 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 插入序列的复制性转座 转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。 IR IR Transposase Gene 有用基因 （二）转座子转座 转座子组成： 反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因 细菌的可流动性元件 A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L 由转座子介导的转座 第二节 重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone 重组DNA技术的发展史 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 本节主要内容： 一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 （一） DNA克隆 技术水平：分子克隆(m