纸片扩散法.PPT

实验五 药敏实验 * 一、实验目的 1、掌握细菌纯化再培养的方法 2、掌握人工药敏实验方法 * 二、药敏试验常用方法 1. 纸片扩散法（Disk Diffusion Test）： Kirby-Bauer法（K-B纸片琼脂扩散法）和直接纸片药敏法 2. 稀释法（Dilution Test）： 包括琼脂稀释法（药物混合在培养基中）和肉汤稀释法（抗生素梯度稀释） 3. 抗生素浓度梯度法-E 试 验（E-test） * 二、实验原理 将含有一定量抗菌药物的纸片或药片，平贴于已接种被检细菌的琼脂培养基上，纸片或药片中的药物即呈梯度向周围扩散，敏感菌株在纸片或药片的周围生长受到抑制，而形成抑菌圈。根据抑菌圈的大小，可判断细菌对抗菌药物的敏感性。 影响药敏结果的因素 一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，且培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子。 二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小。 三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。 四、培养时间：一般在37℃下培养18-24小时。 * 三、实验材料与器材 1、实验材料 分离培养的细菌、平板，药敏纸片 2、实验器材 超净工作台、分光光度计、量尺或游标卡尺 * * 四、实验内容与步骤 （一）倒平板：固体培养基的准备 （二）细菌纯培养及菌悬液的制备 确定细菌的浓度：将细菌离心沉淀后用无菌PBS稀释至OD值为0.2左右（细菌OD600吸光度在0.2-1.5范围内，细菌数与OD值呈线性相关，OD值为0.2的细菌数约为1*108 CFU/mL）。 * * 四、实验内容与步骤 （二）药物敏感试验（纸片琼脂扩散法） ① 取100-200μl菌液均匀涂布平板； ②用无菌镊子将纸片贴于含菌琼脂表面，每面贴3~4个纸片，放置15分钟。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。 ③倒置在28℃培养箱中培养24h观察结果。 ④用尺量包括纸片直径在内的抑菌环最大直径，判定结果（敏感、中度敏感、耐药）。 抑菌圈直径（毫米） 敏感度 20以上 极敏 15-20 高敏 10-14 中敏 10以下 低敏 0 不敏 药物敏感实验判定标准 * 具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。 * 四、思考题 1、药敏试验常用方法有哪几种？ 2、影响药敏结果的因素有哪些？