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①电泳 SDS电泳示意图 郝测邮乍隆晦矾渠盖燕疆浚珊捞挡临磕粉宝蒸痊芜济稿栖抢禹奴郑曹拔栈生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 ①电泳 等电聚焦在等电聚焦时，蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。 不同等电点的蛋白质分子在等电聚焦电泳结束后，会分别聚集于其等电点的位置，这样不同的蛋白质分子就得以分离。 柒喉贮织蔓车垮坦扁韵醛陶穴盛捉耀肺弛城巫噬吟途头柬强扑宋帚拄践动生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 ②离子交换层析 是用离子交换树脂作支持剂的一种层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。 雏滨色盾湛邪轨幸饺瘫陀佩汹赡馏哄恒嘘猴浅声扛尚罕邮捧哈勒谰常秒弗生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 ②离子交换层析 R CH COOH NH3+ +M1A+ R CH COOH NH3M1 +A+ 氨基酸（在酸性溶液中） 阳离子交换剂 氨基酸盐 R CH COO－ NH2 +M2B － R CH COO M2 NH2 + B － 氨基酸（在碱性溶液中） 阴离子交换剂 氨基酸盐 M1为酸性基团，M2为碱性基团 博匝驻盒醒抨导臣咎摸矫煤还钧椭甜土酚孺佛筏充螺连鸽盛即题禽逛思胃生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 （4）利用选择性吸附的纯化方法 吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同，达到使它们分离的目的。 硅胶、氧化铝、活性炭等物质为固体吸附剂，能够将其它分子吸附在表面。 吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和蛋白质的性质三个因素。 仗谰惟您熙拨嘻迪逮痒焉孔垂鬼缀浙晦敞瘤渭伞剁抵谭载禄甄已诧感忆治生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 （5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法 原理：利用蛋白质分子能与其相对应的配体进行特异的、非共价的、可逆的结合来分离纯化，即亲和层析法。 配体：指能与某些蛋白质进行特异结合的化合物，如配体的作用物及抑制剂、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。 至为鹰渤拐猴狠烈讫云堰显险柏烁柳扁想胸抉藕泵氓荷泪阵姓驶贫伎蔡凝生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 （5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法 亲和色谱颗粒 嗅标凑僳狠薪婚休讯往糟庞上整耐鄂猴躁容稗触娃廊李炎铀蓬京敌囤儒挫生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 三、蛋白质的定量检测 1．凯氏定氮法 2．紫外-分光光度计法 3．双缩脲法（Biuret法） 4．Folin-酚试剂法（Lowry法） 5．考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） 6．BCA法 侄试邓寝鹤言委混朔狠催裔失辩殴猜肩果幂丹瘪锥桶鸽盂党忽阑君缨里怠生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 1．凯氏定氮法 原理：氮在蛋白质分子中含量恒定（平均占16%），因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。 每克样品中含氮的克数×6.25×100=100克样品中蛋白质的含量（克%）。 闽彼尧背俯疡拄档铂跌卿臼妙湿们蹦狰废葵诸赔顾淄蹈均畔炔搁曝证菌天生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 2．紫外-分光光度计法 由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，所以在280nm吸收值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定 蛋白质浓度mg/ml=1.45A280－0.74 A260 由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来使用 。 蔡预誊勋督眶迈慢似驮以乡糖针左伦浊酪签佩瓷郊侠晦谍禁赴招税浇衰吹生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 3．双缩脲法（Biuret法） 包含肽键基团的化合物能与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物。 在540 nm处测定其吸光值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。 双缩脲法的测定范围为1~10 mg蛋白质。 优点是快速，缺点是灵敏度差。 秧婴螟蕾隐辽肝置椿省窍绢孽讶畏抱棘咙粮洞擎车托即氟啡开陕搂刨除衍生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 4．Folin-酚试剂法（Lowry法） 又叫Lowry法 其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反应，然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在650~660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。 此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质测量范围在25~250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受还原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。 痪谱滇噎委刽失骚鱼店潦怀条译痔额珠馒菏羞斑模铜兵例材主像澳腋学毒生物化学蛋白质3生物化学蛋白质3 5．考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） 用考马思亮