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基于代谢网络技术的杜仲治疗皮肤光老化的靶向研究 　　[摘要]目的：利用代谢网络技术研究杜仲治疗大鼠皮肤光老化的作用机制和作用靶点。方法：采用经典的皮肤光老化动物模型制备方法，参考临床生化指标对所建立的模型进行评价，判定模型组大鼠皮肤老化程度，采用无歧视的代谢网络分析技术对大鼠的尿液样本进行全局分析，聚焦关键代谢通路和作用靶点。结果：形态学考察发现其具有典型的皮肤光老化特征。皮肤组织的各项指标均显示模型组大鼠机体发生的显著地氧化受损过程，给予杜仲后出现一定回调趋势。尿液代谢轨迹分析发现杜仲具有显著回调皮肤光老化的作用。进一步聚焦分析发现皮肤光老化大鼠的代谢主要集中在花生四烯酸代谢和谷胱甘肽代谢通路，谷胱甘肽过氧化酶可能是其潜在的作用靶点。结论：杜仲对由紫外光照射诱导的皮肤光老化大鼠模型具有很好的回调作用，谷胱甘肽代谢是其涉及的核心代谢通路，谷胱甘肽过氧化酶为其潜在的作用靶点。　　[关键词]杜仲；紫外光；光老化；代谢组学；谷胱甘肽　　[中图分类号] [文献标志码]A [文章编号]1008--0070-03　　杜仲为杜仲科植物杜仲干燥茎皮，杜仲在我国已有XX多年的药用历史。《神农本草经》将杜仲列为上品，杜仲是名贵滋补药材，具有补中益精气、强筋骨、强志、安胎、久服轻身耐老之功效。本研究依托药效学及代谢组学技术对皮肤光老化大鼠的代谢机制和杜仲干预皮肤光老化大鼠的作用机制进行研究，为杜仲防治皮肤光老化及延缓衰老作用研究提供实验依据。　　1材料和方法　　仪器及试剂：AB SCIEX Triple QuadTM 3500；XPE105分析天平；RT-9000半自动生化分析仪；紫外线照射仪；紫外线辐照器；VDUPL超纯水机；羟脯氨酸试剂盒、总超氧化物歧化酶试剂盒、丙二醛试剂盒。杜仲购自贵州贵阳市，经黑龙江中医药大学陈孝忠副教授鉴定为杜仲科杜仲属杜仲的干燥树皮。　　动物及光老化动物模型制备：Sprague-Dawley大鼠雌雄各半，体重g。黑龙江中医药大学实验动物中心提供，饲养于佳木斯大学动物实验中心，自由饮食饮水。剔除大鼠背部毛发，紫外光局部照射处理复制大鼠光老化模型。18只健康SD大鼠按体重随机分为3组，分别为空白组、模型组和给药组。大鼠麻醉取背部皮肤，置紫外光下30cm处，给予20min紫外线照射，OVA剂量为70J/cm2，隔日给予，共计3h。空白组背部剃毛处理、无紫外光照射处理。给药组灌胃给予800mg/kg杜仲提取液溶液，连续18d，模型组给予等量生理盐水。　　口服溶液制备：杜仲药材提取液溶于蒸馏水中制成/ml的灌胃溶液。　　生物样本的采集及制备：实验第19天早各组实验动物给予乌拉坦腹腔注射麻醉后，采集背部皮肤组织样本，面积约1cm×1cm背部皮肤组织，制备成皮肤组织匀浆液，分别取10μl、100μl和100μl，依据相应试剂盒使用说明方法用于皮肤组织T-SOD、N）A、HYP含量测定。模型制备过程中隔天早8点开始收集12h尿液，并离心，取上清液置于-80℃环境下保存，尿液代谢样本采取原尿液与水1：4比例混溶，离心，过μm滤膜作为供试品溶液。　　色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3；流动相%的甲酸乙腈溶液，流动相%的甲酸水溶液；柱温35℃；流速/min；进样量2μl；梯度洗脱方法见表1。　　离子喷雾电压：6KV；离子源温度：500℃；碰撞能量：30eV；氮气为雾化气和辅助气：雾化气55psi，辅助气55 psi。质量范围为全扫描，积累时间250ms。工作站为Analyst TF 软件。　　统计学分析：采用数据处理软件对组间生化指标进行分析，T’TEST值小于有统计学差异；代谢组学数据采用AB公司分析软件Peak View对进行数据预处理，在此基础上进行模式识别分析SIMCA ，以正交偏最小二乘判别分析筛选尿液潜在生物标记物。　　2结果　　生化指标检测结果：与空白组相比，模型组大鼠皮肤组织中的T-SOD活性明显降低，具有显著性差异，MDA含量显著升高，具有极显著性差异，光老化大鼠皮肤中羟脯氨酸HYP含量显著减少，具有极显著性差异，给予杜仲提取液后，呈回调趋势。见表2。　　尿液代谢组学研究结果：光老化多维数如图1所示，对上述数据进行模式识别分析以筛选潜在生物标记物。如图2所示，空白组和模型组两组分离明显，给药组代谢轮廓处于空白组和模型组间，且部分给药组与空白组重合，证明给药组的代谢整体向健康状态发展，杜仲对紫外照射的皮肤光老化有很好的治疗作用。进一步通过模式识别技术筛选出具有统计学差异的小分子代谢产物。同时结合数据库进行检索，共鉴定出皮肤光老化尿液潜核心生物标记物6个，分别是氧化谷胱甘肽、L-氨基酸、双γ-谷氨酰胱氨、甘氨酸、O-磷酸-L-氨酸、L-氨酸，其中主要代谢物，如氧化谷胱甘肽的代谢网络