YC/T 150-2002烟草种子　转基因的测定.pdf

ICS65.160 x85 备案号:10587-2002 中华 人 民共 和 国烟 草行 业标 准 YC/T150-2002 烟草种子 转基因的测定 Tobaccoseed-Determinationofgeneticallymodifiedorganism 2002一09一12发布 2002一12一01实施 国家烟草专卖局 发布 657 YC/T150-2002 前 言 本标准由全国烟草标准化委员会农业分技术委员会提出。 本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国烟草东北农业试验站。 本标准主要起草人:焦庆明、郭兆奎、闺新甫、万秀清、于艳华、魏继承。 YC/T150-2002 烟草种子 转基因的测定 1 范围 本标准规定了烟草种子转基因的测定方法。 本标准适用于烟草种子。 2 引用标准 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 YC/T149-2002 烟草及烟草制品 转基因的测定 3 术语 应符合YC/T149-2002第2章的规定。 4 实验室要求 应符合YC/T149-2002第3章的要求。 5 试剂 应符合YC/T149-2002第4章的要求。 6 仪器与耗材 应符合YC/T149-2002第5章的要求。 7 样品的取样方法 以品种为单位，即每个品种作为一个样品，对虽为同一品种，但种子产地或种子生产年份不同，也作 为单一样品取样，每一样品随机多点取样10g，样品编号注明品种名称、种子产地和生产年份。 8 DNA提取 8.1 前处理 随机取烟草种子。.5g放人装有滤纸保湿的培养皿中，28℃光照下培养5d，种子萌发出苗后，用滤 纸吸出表面水分。 8.2 DNA提取 8.2.1 种子萌发后提取 8.2.1.1种子萌发幼苗称量约300mg，在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末，装人1.5ml，离心管中。 8.2.1.2 取300mg液氮研磨后的粉末，加入200pl.2XCTAB提取缓冲液，充分混匀后，65C水浴 10min, 82.1.3 加人等体积的三氯甲烷 :异戊醇(24e1)，混合均匀12000r/min离心4min. YC/T150-2002 8.2.1.4 取上清液，加 1/1。体积的10%CTAB提取缓冲液，加人等体积的三抓甲烷 :异戊醇 (24:1),混合均匀后12000g离心4min, 8.2.1.5 取上清，加等体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀15000r/min离心8min, 8.2.1.6 去上清，沉淀加100uL高盐TE缓冲液，65℃水浴10min, 8.2.1.7 加人二倍体积冷无水乙醇，于一40C下30min, 8.2.18 isooog离心8min，沉淀溶于70IA-超纯水中。 8.2.2 种子未经萌发直接提取 8.2.2.1将烟草种子浸泡于无菌水中过夜或放人65C水中1h，取100mg膨涨的种子放人2mL离心 管中捣碎，加人50o讨.1XCTAB抽提缓冲液，剧烈振荡混合均匀后放人65C的恒温水浴中30min。再 12000g离心10min. 8.2-2.2 取上清液，加200,1L三氯甲烷混合均匀，12000r/min离心10min, 8.2-2.3取上清液，加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温下1h,12000g离心5min, 8.2.2.4 去上清液，沉淀加人350川高