琼脂糖凝胶电泳试验技巧.pdf

美好明日 美好未来 琼脂糖凝胶电泳实验技巧 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因 而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子， 使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而 达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此 成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。 一、操作过程中要注意以下一些问题。 1、凝胶制作 1.1 凝胶浓度 凝胶的浓度据实验需要而变 ，一般在0.8％～2.0％之间，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加， 水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶 后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶 条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化 的琼脂糖中，终浓度为0.5t*g／ml；也可在电泳结束后染色。 1.2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孔容积较大，用于DNA 片段回收实验等； 相反，梳齿窄而薄，形成的点样孔容积就较小，用于 PCR 产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少 而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都 要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孔的破 坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有 液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孔。 2、点样 在样品中加入上样缓冲液，上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度，使样品沉入孔底；上样缓冲液中一般还含 有两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发 下才能看见桔红色荧光)，用于指示样品的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为6×(10×)，表示其浓度为工作浓度的 六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直对准点样孔，用另一只手帮助固定移液器 下端，移液器枪头(Tip)尖端进入点样孔即可将样品注入孔内，千万不可将Tip尖插至孔底。同时点上适合的DNA分子 量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA 分子量标准范围之内。 3 电泳 将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连。核酸带负电荷，从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲 液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶 1mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时 所加电压一般不超过5v／cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为3O～60 min，根据实 验需要也可作适当调整。电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳 时间较长，核酸条带整齐清晰。 另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。 4 结果分析 较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰。 北京明日百傲生物科技发展研究所 01062819319 美好明日 美好未来 二、DNA 电泳常见问题分析 常见问题 原因 对策 DNA带模糊 DNA降解 实验过程避免核酸酶污染 电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能