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《基因工程》探索性综合性实验一 龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 (Galactose-1-phosphate uridylyltransferase，GPU）基因拷贝数的确定 背景情况介绍 Division:  RhodophytaClass : RhodophyceaeSub-class: Florideae Order: Gigartinales Family : Gracilariaceae 实验过程要求 根据题目通过网络和杂志查阅文献，提交实验准备报告，内容包括。 题目名称、原理、技术路线、具体实验步骤、需要使用的试剂（溶液）名称及其具体配制方案、其它需要使用的消耗材料（需要器皿清单） 注意事项：独立完成 实验原理 基因组DNA用多种不同的限制性内切酶酶切，用GPU基因探针杂交，若有多拷贝，则应有多个杂交带，若多数酶切结果显示单一条带则为单拷贝。 实验材料和试剂（/组） 红藻 2.5 g；CTAB缓冲液5 ml ； 酚/氯仿/异戊醇抽提液 2ml ；10T/1E 1ml ；10T/0.1E 1ml；3M醋酸钠溶液 1ml 变性液 20 ml；中和液 40ml；转移液 100ml；洗膜液I 10 ml；洗膜液II 10ml；缓冲液I 100ml；缓冲液II 20ml；缓冲液III 20 ml；显色液 10ml；缓冲液IV 30ml 实验步骤 1、红藻总DNA的提取 称取2.5g藻，加1~2 ml/g CTAB缓冲液（勿忘加巯基乙醇），加2g PVPP固体，在冰浴中用力充分研磨（大约半小时）。然后转移于塑料离心管中在 60-65℃ 温浴 30 min，不时颠倒混合，加蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100?g/ml，50℃ 3h，不时颠倒混合，用等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）（取下层有机相）抽提（颠倒混合）10 min，12000 rpm 离心 5 min，取上清，用氯仿抽提5 min，12000 rpm 离心 5min。取上清液，加入 2/3 体积的异丙醇，颠倒混合，在 -20℃ 下沉淀 15 min，再于室温 12000 rpm 离心 15 min，祛除上清，用1ml 70% 乙醇洗沉淀，12000 rpm 离心 15 min，祛除上清，空气干燥沉淀。37℃ 下，把核酸溶在 100-200 ?l TE1（10 mM Tris-Hcl，pH 8.0，1 mM EDTA）10 min，14000 rpm 离心 5 min。在不干扰沉淀的情况下，把上清液移到新的微量管中，加RNase(10mg/ml)至终浓度100?g/ml，37℃消化30 min，酚-氯仿抽提后，加1/10体积3M醋酸钠和 2 倍体积 的 -20℃无水乙醇，立即离心使DNA沉淀，用 70% 的 -20℃ 乙醇洗涤沉淀DNA，空气干燥，把DNA溶在 50?l TE2（10 mM Tris，pH 8.0，0.1 mM EDTA）。 2、取5?l 龙须菜总DNA制品加1/10体积载样缓冲液做电泳检测，并加5?l分子量对照，目测定量。 3、用3~4种（每组选择一种）限制性内切酶酶切 5?g/种，一般20?l酶切体系/1?gDNA （见说明书）, 等量放大。完全酶切过夜后于80v 1.0%琼脂糖凝胶电泳1h，并加5?l分子量对照。记录Marker各条带及样品位置，做Southern转迹。 4、探针的制备和标记 对提取的含目的基因的质粒，按试剂盒说明标记探针及检测标记率，按试剂盒操作说明P13表准备标记探针和对照，管2~9各1?l 点于膜上，膜自然晾干，80℃烘烤2h，进行显色操作。探针稀释到终浓度10ng/?l。 5、Southern Blot： 将凝胶放入培养皿中，加入20ml变性液（没过凝胶），摇动变性1h，倾去变性液，用蒸馏水漂洗一次；换中和液20ml，摇动1h，之间更换一次中和液；在电泳槽内加适量转移液20XSSC，中间支架放一滤纸条，滤纸两端浸没在20XSSC中，滤纸与支架间不能有气泡，取出中和的凝胶，点样孔朝下倒扣于滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸的气泡，剪一张与胶大小相同的NC膜，放在无菌蒸馏水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20XSSC中浸泡5min，将湿润的膜盖在凝胶上面，膜一经与凝胶接触，不可再移动；将两张与膜大小相同的滤纸置2XSSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡，滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（高8~10cm），吸水纸上压0.5~1 kg重物，转移12h。 6、转移后，在膜上做标记，紫外检测凝胶转移效果，膜自然晾干，80℃烘烤2h。 7、膜的预杂交、杂交和显色。 37~42℃预热DigEasyHyb，以1.2ml/12c