竞争ELISA法测定抗体亲和力.PDF

活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 竞争 ELISA 法测定抗体亲和力 抗体亲和力测定的方法很多 ，竞争 ELISA 法是一种简便易行的亲和力测定方法 ，本文主要介绍竞争 ELISA 法测定抗 体亲和力的原理、操作步骤以及注意事项。如果想了解更多抗体亲和力的测定方法 ，查看抗体亲和力测定方法介绍。 原理 抗原抗体的结合是一个可逆的反应 ：A+B ⇋AB （A 表示抗体 ，B表示抗原 ，AB表示抗原抗体结合物 ）。 当反应达到平衡时 ，解离常数 K =[A][B]/[AB] ，[AB]表示反应平衡时抗原抗体结合物的浓度 ，[A]表示反应平衡时 d 游离抗体的浓度 ，[B]表示反应平衡时游离抗原的浓度。 ① 当反应体系中抗体很少 ，而抗原过量时 ，反应平衡后[AB][A] ； ② 当反应体系中抗原量很少 ，而抗体过量时 ，反应达到平衡后[AB][A] ； ③ 当反应体系中抗原抗体的量刚好合适时 ，反应达到平衡后处于半饱和状态 ，此时[AB]=[A],则 K =[A][B]/[AB]=[B]。 d 在半饱和状态下 ，如果抗体的浓度很低 ，反应消耗的抗原很少 ，则反应后游离的抗原浓度[B]约等于总的抗体浓度[B] ，此时 K =[B]≈[B] 。因此 ，只要在抗体浓度较低的情况下 ，找到可以在反应平衡后达到半饱和状态的抗原浓度[B] 总 d 总 总 ，便可以得到解离常数。 操作步骤 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋 白整体 方案 Active Protein Solutions 竞争 ELISA 法测出的 K 值的准确性 ，依赖于一个大前提 ：将反应混合物加入包被抗原板后 ，包被抗原与游离抗体 d 的结合不会破坏抗原抗体反应体系的平衡状态 （如果抗原板中抗原浓度过高 ，结合的游离抗体超过了一定的量 ，抗 原抗体反应体系的平衡会被破坏 ，此时测得的 OD值偏大 ，最终导致结果偏大 ）。通常允许抗原板结合的最大游离 的抗体量为 10%。在进行 ELISA 法检测抗体亲和力实验时 ，需要确保抗原不会破坏反应体系的平衡。通常可以用 以下操作步骤来确定该包被抗原的浓度是否过高 ： 包被抗原板 ，然后用 3%的 MPBS室温封闭 2h ，PBS洗涤 ； 准备梯度稀释的抗体溶液（稀释前的抗体浓度与竞争 ELISA实验中的抗体浓度相同 ），每个稀释液取 100mL ； 加入第一块抗原板中 ，一式三份 （见下图 a ），孵育 1个小时 ； 使用微量移液器小心移出第一块板中抗体稀释液 ，将三份相同浓度的稀释液放入一个管中 ，每个稀释液取 100mL加入第二块抗原板中 ，一式两份 （见下图 b ），孵育 1个小时 ，PBS洗涤 ； 加入酶标二抗 ，孵育 1个小时 ，PBS洗涤 ； 每个孔中加 100μl底物 ，显色 30min ； 终止显色反应 ，测定各个孔 OD值 ； 将得到 OD值与对应的抗体浓度结合 ，分别就第一块抗原板与第二块抗原板做两条拟合曲线 （见下图 c ）；  对比两条曲线 ，如果之间的差值小于 10% ，则说明该包被抗原的浓度符合要求 ，如果大于 10% ，则说明该 包被抗原浓度过高 ，需对包被抗原进行稀释后重新测定。 Tel:(025) 5889-4959 www.DetaiB Sales@DetaiB