实时检测限制性内切酶活性的发夹型荧光探针-Core.PDF

生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 ISSN ACTA B IOCHIM ICA et B IOPH YSICA SIN ICA 2002 , 34 (3) : 329 - 332 CN 3 11300/ Q 实时检测限制性内切酶活性的发夹型荧光探针 张永有 　李庆阁 　梁基选 　朱艳冰 ( 厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 , 厦门 36 1005 ) 摘要 　　基于分子信标的原理 , 设计了一种发夹型荧光探针作为限制性内切酶作用的专一底物 ,来研究限制性内 切酶的剪切作用 。检测 B g l II 和 N coI 表明 , 这种探针不仅可以灵敏 、实时地指示内切酶的活性 , 采用不同荧光标 记的探针还可以同时特异地显示双酶切反应中两个酶各自的活性 。并且以 RotorGene 2000 实时荧光 PCR 仪作仪 器检测 , 实现了高通量的操作 。利用其特有的作变温曲线的功能 , 能很好的区分限制性内切酶与发夹型荧光探针 的特异剪切与非特异的结合 。 关键词 　　限制性内切酶 ; 发夹探针 ; 实时检测 　　限制性内切酶的发现与应用是基因工程技术迅 上引入少量无关碱基 , 使探针在常态下保持闭合状 速发展的关键 , 限制性内切酶不仅在 DNA 重组中 态而不发荧光 ; 限制性内切酶作用后 , 随着“臂”被 发挥作用 , 在基因结构分析中也是不可缺少的工 酶切 , 发夹探针结构受到破坏而发出荧光 。根据荧 具 。因此 , 其活性检测意义显著 , 并可进一步用于 光动力学曲线 , 可以定量指示酶的活性 。由于标记 研究核酸损伤和核酸酶抑制剂等方面 , 以及作为药 的荧光物质可以是不同颜色的荧光物质 , 因此针对 物筛选的靶点 。然而 目前对限制性内切酶的活性普 不同的限制性内切酶可以合成出不同荧光标记的探 遍缺乏定量描述 , 因为传统检测限制性内切酶活性 针 , 据此可 以同时检测多个限制性 内切酶的活性 λ ( ) 的方法是将标准的 DNA 与限制性内切酶反应 , 凝 图 1 。 胶电泳观察酶切效果 , 这种方法至多给出半定量结 果 , 而且操作麻烦 , 重复性差 , 更不能实时给出不 ( ) 1 　材料和方法 Materials and Met hods 同条件下的酶活性变化 。近年来 , 基于荧光共振能 1. 1 　试剂 量转移原理标记的寡核苷酸探针检测限制性内切酶 限制性内切酶 B g l II 和 N coI 及其配套试剂购 的方法得到一定的发展[ 1～3 ] , 但灵敏度仍较低 , 且 自大连宝生物技术公司 。荧光探针 P ( B g l II) : Fam 无法 同时检测多个酶切反应 。因此 , 发展一种快 5′CA GA TC TCAAAA GA GA TC T G3 ′Dabcyl 和 P 速 、准确 、灵敏的定量检测限制性内切酶活性的方 ( N coI ) : Tet5′ACCA T GGAAAAAA TCCA T GGT 法 , 将有重要价值 。 3 ′Dabcyl 分别表示 B g l II 和 N coI 的探针 , 由上海 本文提出一种新的探针设计 , 可以满足上述检 博亚生物技术公司合成 , 用酶切反应溶液配成 50 测要求 。该探针基于分子信标的原理[4 ]