表皮生长因子刺激对肺腺癌细胞系产生的外泌体的影响Effectof.PDF

学校代码：10023 学 号：200801088 表皮生长因子刺激对肺腺癌细胞系 产生的外泌体的影响 Effect of epithelial growth factor on exosomes in lung adenocarcinoma cell line 专业年级： 临床医学专业 2008 级 姓 名： 郭威 指导老师： 吕志民 教授 导师小组： 赫捷 院士、吕志民 教授 北京协和医学院 中国医学科学院肿瘤医院 胸外科 完成日期： 2016 年 6 月 1 目录 目录 2 摘要 4 ABSTRACT 5 中英文缩略词表 7 引言 9 1 实验材料 11 1.1 实验试剂 11 1.2 主要仪器设备 12 1.3 实验溶剂 13 2 实验方法 14 2.1 细胞培养及表皮生长因子处理 14 2.1.1 细胞的复苏 14 2.1.2 细胞的培养和传代 14 2.1.3 细胞的冻存 15 2.1.4 表皮生长因子处理处理及细胞上清的收集 15 2.2 超高速离心法分离外泌体 16 2.3 外泌体的鉴定 16 2.3.1 透射电子显微镜观察外泌体的形态 16 2.3.2 纳米示踪分析观察外泌体粒径分布及颗粒浓度 17 2.3.3 Western 印记检测外泌体内源性蛋白表达水平 17 2.3.3.1 细胞总蛋白的提取 17 2.3.3.2 外泌体蛋白的提取 18 2.3.3.3 蛋白浓度的测定 18 2.3.3.4 Western blot 蛋白印记检测蛋白表达水平 20 2.4 荧光共聚焦显微镜观察肺腺癌细胞摄取外泌体 21 2.4.1 外泌体的染色 21 2 2.4.2 荧光共聚焦显微镜上样制片 22 2.5 细胞学实验 22 2.5.1 细胞增殖实验 22 2.5.2 细胞迁移实验 23 2.5.3 细胞侵袭实验 24 2.6 统计学分析方法 24 3 实验结果 25 3.1 EGF 对外泌体基本特征的影响 25 3.1.1 EGF 对肺腺癌 H322 细胞的影响 25 3.1.1.1 EGF 处理 H322 细胞形态的变化 25 3.1.1.2 EGF 处理后 H322 细胞增殖、侵袭、转移能力明显升高 26 3.1.2 EGF 刺激对外泌体形态和颗粒直径的影响 29 3.1.2 纳米颗粒示踪检测外泌体粒径分布与颗粒浓度 31 3.1.3 Western-blot 蛋白印记检测外泌体特异性蛋白的表达 33 3.1.4 EGF 处理对 H322 细胞外泌体分泌量的影响 34 3.2 EGF 对外泌体生