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创伤弧菌溶血素基因的高效表达与鉴定 作者：魏杰 作者单位：兰州大学公共卫生学院卫生毒理学教 研室，甘肃兰州 【摘要】冃的：构建创伤弧菌溶血素基因(vvc)的融合表达 载体，并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达.方法：用一 对创伤弧菌溶血素基因特异性引物从创伤弧菌基因组DNA中钓取 vvc基因，T A克隆后测定核甘酸序列，构建pET 32a(+)- vvc 融合表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达，表达产物 行SDS PAGE并进行Western Blot鉴定.结果：构建了 pET 32a(+) vvc融合表达载体，DNA测序证明，获得的vvc基因长度为 1311 bp,与GenBank中报道的创伤弧菌溶血素基因序列完全一致. SDS PAGE分析表明,vvc融合蛋口 Mr为71X103,其表达量约占 菌体总蛋白的32%. Western blot结果显示，0的蛋白可与创伤弧菌免 疫后的小鼠血清特异性结合.结论：成功地实现了 VVC基因在大肠 杆菌中的高效表达，为进一步研究vvc蛋白的生物学功能奠定基础. 【关键词】弧菌，创伤，溶血素类，基因表达 0引言 创伤弧菌(Vibrio vulnificus, Vv)自然存在于近海和海湾的海 水和海底沉积物中[1],人体感染后病情发展迅速，最终发展为感染 性休克、多器官衰竭而死亡，死亡率高达70%[2].创伤弧菌溶血素 (Vibrio vulnificus cytolysin, vvc)的活性高达 81 000 溶细胞单位 (HU/mg),给实验小鼠尾静脉注射毫克级以下水平的vvc就可以引发 死亡［3］.体外实验研究表明，vvc对肥大细胞［4］、红细胞［5］等哺乳动 物的细胞都可以产生显著的细胞毒性作用，但其确切的致病机制还不 十分清楚.本研究构建了 pET 32a(+) vvc原核表达系统，采用创 伤弧菌全菌抗体对融合蛋白进行鉴定，为今后创伤弧菌快速诊断试剂 盒的制备及VVC基因表达调控机理和功能研究奠定基础. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌种、载体与实验动物创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血 性弧菌为海军总医院检验科实验室保存菌种;大肠杆菌DH5 A、 BL21(DE3)、原核表达载体pET 32a(+)以及BALB/c小鼠均來自木 实验室. 1.1.2工具酶与主要试剂PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、凝 胶冋收试剂盒、溶菌酶Lysozyme、DNA和蛋白质Marker均为北京 天根试剂公司产品;限制性内切酶BamH I和Hind III、T4 DNA连接 酶和pGEM T Easy购于Promega公司. 1.2方法 1.2.1细菌活化将创伤弧菌菌株按1 ： 100接种于预先预热至 37°C的LB培养基中，37°C 220 r/min振摇培养6 h,以待备用. 1.2.2模板制备取1.5 mL活化菌液于13 000 g离心2 min, 彻底倒尽上清液，用双蒸水洗涤一次，13 000g离心2 min,去上清, 将菌体悬浮，盖上盖子，在沸水中煮5 min, 13 000 g离心5 min,将 上清储存在-20°C,取2~4 ML进行PCR. 123引物设计根据GenBank公布的创伤弧菌VVC基因核 昔酸序列和内切酶图谱分析结果口行设计含有合适内切酶位点的特 异性引物?vvc引物序列：上游5’ CGCGGATCCCAAGAATATGTGCCGATTGTT 3’ (BamH I ),下游 5 CCCAAGCTTGAG TTTGACCTGTTGTAATGT 3 (Hind III),送上海生工生物公司合成. 1.2.4PCR反应PCR反应总体积为25 ML,引物浓度为10 M mol/L, 50 ng DNA模板?PCR反应条件为:94°C预变性5 min;94°C变 性30 s;58°C复性45 s;72°C延伸1 min共30个循环;72°C继续延伸10 min?待反应结束后，取5 ML扩增产物于10 g/L的琼脂糖凝胶电泳 检测扩增产物. 1.2.5vvc基因的纯化与回收按照DNA胶回收试剂盒操作说 明，从琼脂糖电泳中将目的条带切下，用胶冋收试剂盒冋收纯化PCR 产物. 1.2.6T A克隆、测序与表达载体的构建应用T A克隆 试剂盒，将扩增的目的片断克隆至pGEM T载体，转化于E. coli DH 5 A感受态细胞中37°C过夜培养，在平板上挑取单个菌落，进行PCR 鉴定，获得满意测序结果后，通过质粒提取试剂盒小量制备质粒 pGEM T vvc 和 pET 32a(+),利用 BamH I 和 Hindlll分别进 Jiff行双酶切，回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下将vvc基因酶切 Jiff 片段与pET 32a(+)酶切产物16°C连接过夜，构