PCR在突变基因检测时的应用-上海闪晶-荧光定量PCR-慢病毒包装.PDFVIP

PCR 在突变基因检测时的应用 分子生物学在医学领域中的应用越来越广泛，基因突变在肿瘤和遗传病的发生过程中的作用 也日益受到重视，因此检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)也成为了分 子生物学，医学遗传学以及肿瘤学研究 中的热点。 基因突变（ (gene mutation)是癌基因激活，抗癌基因失活以及遗传病发生的原因，从广义 上讲，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变等三种形式，后两种基因突变涉及的基因 较多，可以通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中 期的染色体来检出.也可以在细胞的有丝分裂间 期用标记探针检出，而点突变涉及的范围较少，是肿癌和遗传病发生的主要分子机制，是基因分 析的主要研究内容.一般来说，基因突变的检测方法包括：应用基因探针直接检测；应用 PCR 技 术检测；利用探针技术进行分析。 利用核酸探针及 Southern 印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满足这际工 作的需要，自从 PCR 技术问世以来，建立于 PCR 技术基础上的突变基因检测技 术发展迅速，它 不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织 亦可经 PCR 扩增而进行中 种检测，加上 PCR 技术与探针杂交技术，RFLP 技术及 PCR 直接 测序的结合，改换方法得以迅速 发展和推广，大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因 的研究进展. 一、点突变的 PCR 直接检出 (一)用PCR 直接检测缺失: 当基因内缺失时，可用已知的该基因 DNA 序列在缺失片段的两侧设计一对引物， 然后进行 PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外检测仪下检测有无特异 性的扩增产物，即可 非常容易的判断待检称本中有无 DNA 片段的缺失. 1.一对引物PCR 检测缺失如果一个基因的 DNA 序列已经清楚，其缺失部位亦较为固 定，即 可根据缺失发生区域的 DNA 序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行 PCR， 然后琼脂糖凝 胶电泳及溴乙锭染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方 法是检测基因片段缺失 最为快速的方法，在实际应用中，为了避光因某些原因引起的 扩增失败而导致假阴性结果的出 现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因 引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩 增带并非因反应体系的原因的引起.如在应 用 PCR 技术进行 X 地贫 Bartα 基因胎儿水肿综合征 义基因缺失检测时，常用一对引物扩 增缺失区域，同时同一对 β基因引物扩增 β基因的一个 1 热线电话：021 8009881995 E-mail:master@ 网址： 片段，然后电泳检测.若同时 即有 α 和 β 基因的特异性扩增产物，则说明 α基因的扩增产物 则说明模板 DNA 中有 α 基因的缺失，为Bart 胎儿水肿综合征. 2.多对引物的多重 PCR 检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质 性，即在不同患者其缺 失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出， 在这种情况 下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一 PCR 体系扩增多 个 外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如， 则可判 定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行 的检测途径，目 前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在 DMD/BMD 缺失型突变的检测 中，用 23 对引物分为三组 进行多重 PCR 可改 98%的缺失得以检出，另外还有人用 9 对物 进行两组多重 PCR，大约可检出 DMD/BMD92%的缺失型突变. 3.用 PCR 技术进行杂合性丢失的检测：有报道，PCR 技术尚可用于检测杂合性丢失可采用 PCR-SSCP 及 PCR 定量技术进行检 测. (二)单个碱量置换的PCR 直接检出 1.直接检测限制性内切酶切点的变化-PCR 产物酶解分析 PCR 产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变--包括所增加的酶切位 点及原有的 酶切点消失的单碱是量置换性点突变.当某一点突变引起 DNA 片段中酶切位 点发生改变时，则可 用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的 DNA 片段，然后用相应 的内切酶进行处理，电泳检测， 与正常的无改变的段进行对片分析即可确