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谢谢大家！ 感谢您的观看！ Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzers DNA测序分析常见问题整理 测序结果—峰图 四色图谱：每一种颜色对应一种碱基 A T C G 引物 DNA模板 纯化 困难模板 机器影响 影响测序质量的主要因素 一、引物对测序结果的影响 ① 引物合成时多（少）一个碱基 ② 引物不纯 ③ 模板上没有引物结合位点 ④ 引物二聚体 ⑤ 双引物结合 合成时部分引物 多一个碱基 合成时部分引物 少一个碱基 ● 现象：每个峰后面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物 ● 现象：每个峰前面有个同样荧光信 号的小“尾巴”。 ● 原因：合成时引物多一个碱基。 ● 对策：重新合成引物 引物（模板）不纯 ● 现象：整个峰图噪音都比较高。（区别与小片段的干扰） ● 原因：引物（模板）纯度太低，含有较多杂质 ● 对策： –建议使用HPLC（柱子纯化）或PAGE 纯化的测序引物。 –脱盐纯化的引物纯度较低，适合做普通PCR，但不建议用来测序。 模板上没有引物结合位点 ● 现象：没有特异性的测序峰图 ● 原因：引物无法结合模板 ● 对策 重新设计引物 引物二聚体 ● 现象：前面100多bp噪音高，后面正常（引物二聚体片段小大在100bp左右） ● 原因：引物二聚体未去除干净 ● 对策：割胶纯化 双引物结合 ● 现象：从一开始（区别于非单克隆）就出现两套峰 ● 原因：模板有两个引物结合位点，同时和两个引物结合 ● 对策：重新设计单个引物 二、模板对测序结果的影响 ① 模板不纯 ② 点突变（SNP） ③ 移码突变 ④ 杂合子 ⑤ 非单克隆 噪音信号高 终止峰 PCR正常终止 后面的噪音峰 PCR正常终止 正常模板与噪音 模板不纯（非特异性PCR产物） ● 现象：每个峰下面都有其它颜色 ● 原因：PCR主带与杂带混在一起测序 ● 对策：凝胶电泳回收主带，重新测序 割胶纯化 点突变（SNP） 突变点 如果模板有单核苷酸（碱基）突变（SNP），测序图形中其他的位点一般都是单一的 峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰(如图中箭头所示)。 移码突变 在450bp处因点突变导致移码，在528bp处又因点突变恢复 杂合子 杂合变点 杂合信号处的套峰强度大小相等，都相当于正常峰值的一半。 非单克隆 特征：左边清晰，右边全部像杂合子原因：挑克隆时两个质粒混在一起 对策：新挑克隆，重新制DNA 三、纯化对测序结果的影响 ① 染料峰 ② 酒精峰 ③ 荧光物质污染 ④ 钉子峰 ⑤ 有机物污染（瀑布效应） 染料峰 特征：染料峰位于序列的前100bp左右，是残余的A、T、C、G、 4个BigDye峰，其不影响其它序列的可靠性。 酒精峰 特征：酒精峰位于序列的200bp-300bp碱基之间，图谱被“透明” 抬高，其同样不影响其它序列的可靠性。 荧光物质污染 ● 现象：红色峰异常高。 ● 原因：未知大分子荧光物质污染，恰好是红色，被软件误认为红色峰。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。 “钉子”峰 ● 现象：四色并存突然拔起的尖峰，峰形锐利。 ● 原因：毛细管内有气泡、灰尘、尿素结晶等，对激光全反射。 ● 对策 – 灌胶时，避免气泡产生； – 上样前，样品先离心； – 毛细管、检测窗口保持清洁； – 胶内有尿素结晶时，注意不要吸进注射器； – 样品纯化干净。 有机物污染（瀑布效应） ● 现象：基线从高处突然下降。 ● 原因：有机物进入毛细管，受激发产生一定波长的荧光，抬高基线。 ● 对策：依次更换水、缓冲液、甲酰胺、测序胶、毛细管；清洗或更换胶引导块、针筒。 四、困难模板对测序结果的影响 ① 特殊结构 ② Ploy结构 ③ 高GC ④ 重复序列 ⑤ 回文结构 特殊结构 Poly结构 Poly在序列的前端对信号影响较小, Poly在序列的后端对信号影响较大。 Poly-G/poly-C 很容易导致信号中断和信号乱。 高GC Poly-G/poly-C 是高GC的一种，很容易导致信号衰减。 局部高GC一般会导致信号中断和乱峰。 重复序列 GT 重复导致信号衰减 A/G重复导致信号衰减 或信号乱 回文结构 其他复杂的二级结构也会导致衰减 四、机器因素对测序结果的影响 ① 毛细管寿命 ② 其它 毛细管寿命 突起部分 峰的左右不对称，向后拖，有小突起