实验二：目的基因的PCR扩增(含结果).docVIP

实验二 热休克蛋白HSP90的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程： 一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃ 二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延伸。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃ PCR反应包含的七种基本成分： 热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃ 模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 实验目的：学习PCR反应的基本原理和基本技术。 二 、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 移液枪（0.5-10μL 5-50μL） 枪头 实验操作 将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液 2.5μl 5端引物 1.5μl 3端引物 1.5μl DDW 15μl dNTP 2.5μl Taq酶 0.1μl 模板 1 μl 按照以下方法进行PCR扩增： 预变性： 96oC 5min 30个循环： 95 oC 45min,60 oC 45min, 72 oC 150min； 延伸： 72 oC 10min 注：聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来的。 抽取每种扩增样品5-10μl，用琼脂糖电泳来分析扩增结果， 用DNA marker 来判断扩增片段的大小 。凝胶一般用Goldview染色后观察扩增的量与片段大小。 从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的效率；阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。 PCR常见问题及解决方案实验注意事项： PCR常见问题及解决方案 问题 可能原因 解决方法 无产物或产量低 模板浓度偏低或偏高 电泳检测模板浓度，调整模板用量 模板降解 重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存 模板中含有抑制反应的杂质 纯化模板 引物浓度不足 调整引物浓度，特别是针对长片段PCR 引物存在二级结构 重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度 引物降解 引物应高浓度小量分装，-20℃ Mg2+浓度偏低 适当提高Mg2+浓度，从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度 dNTP降解 -20℃ 酶纯度低，扩增效率差 选用高质量DNA聚合酶 酶量不足 适当增加酶量 用酶不当 针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产