用于从MDCK细胞中产生的流感病毒的基因组DNA去除的Capto.PDFVIP

GE Healthcare 应用文献 28-9769-69 AA 疫苗 用于从MDCK细胞中产生的流感病毒的基因组DNA 去除的Capto™ ViralQ的应用 我们已经开发了一种层析的方法用于从细胞培养的流感病 澄清 毒中去除宿主来源的基因组DNA(gDNA)。Capto ViralQ层析 通过把收获物流过两个串联的ULTA™ GF囊式过滤器，先是 介质被用来清除gDNA ，同时把病毒保留在穿透组分中。这 2.0 μm后是0.6 μm ，进行澄清。 个工艺包括在填充Capto ViralQ的96孔过滤板(Predictor)中 筛选最佳的运行条件，在20 mL层析柱中的完整的方法；包 浓缩和洗滤 括gDNA结合能力的测定。结果显示使用含有500 mM NaCl 浓缩步骤用一个500 kDa NMWC的650 cm2中空纤维进行。 的缓冲液适合测试的所有4种流感菌株。病毒产量范围为70% 澄清的物料首先被浓缩10倍，然后通过6倍洗滤到20 mM 到85% ，gDNA的去除超过99.9% ，对数减少因子为2到4-取 Tris-HCl ，0.5 M NaCl ，pH 7.5中，之后再进行2倍的浓缩。 决于起始样品中gDNA的量。 因此物料总共被浓缩了20倍。三种季节性流感菌株，A/ 介绍 Solomon Islands/3/2006 (H1N1) 、A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)和B/Malaysia/2506/2004用此程序运行具有类似的 疫苗生产中流感病毒纯化过程中不得不去除的主要污染物 结果。在每种情况中，大约80%的总蛋白被去除。 中的一种是基因组/染色体gDNA (gDNA)。在此应用文献中， 我们描述了一种用于从含有病毒的物料中去除gDNA的层析 最佳pH和离子强度的筛选 步骤。整个方法-从运行条件筛选到最终的方法-都是在实验 室规模进行。Capto ViralQ填料被用来清除gDNA ，同时把病 实验设计(DoE)方法被用于筛选pH和缓冲液离子强度以得 毒保留在穿透组分中。定量PCR (qPCR )被用于测定gDNA 到最佳的gDNA去除和最大的病毒(HA)回收率。原料是经 的浓度，单向放射免疫扩散(SRID )被用于测定血凝素(HA) 过澄清和浓缩的A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1)物料。使 的量，作为病毒浓度的测定方法。 用填充Capto ViralQ的96孔过滤板(Predictor)进行筛选，缓 冲液使用含有300到700 mM NaCl的20 mM Tris-HCl ，pH范 材料和方法 围从7到8 。 细胞培养和感染 流感病毒被培养在生长在Cytodex™微载体上的Madine-Darby Canine Kidney (MDCK)细胞中。细胞在感染4 h后被收获。 筛选实验的结果显示穿透组分中的gDNA的量随着离子强度 的提高而增加(即朝向图1等高线图的红色部分)。穿透组分 280nm 组分的DNA水平柱状图 中的gDNA的量不受pH的影响，且用这种浓度的氯化钠没有 电导 看到HA回收率