根癌农杆菌介导深绿木霉高产漆酶菌株的构建和筛选-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（７）：４９５２ 根癌农杆菌介导深绿木霉高产漆酶菌株 的构建和筛选 １ ２ ２ １ １ 段兴鹏 　唐　俊 　陈　捷 　陈红漫 　任大明 （１沈阳农业大学 生物科学技术学院　沈阳　１１０８６６） （２上海交通大学 农业与生物学院／农业部都市农业（南方）重点开放实验室　上海　２０１１０１） 摘要　利用根癌农杆菌介导技术（ＡＴＭＴ）转化深绿木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）Ｔ２３，共获得６个 稳定的转化子。利用愈创木酚法对转化子进行筛选，发现３株转化子产漆酶能力显著高于出发菌 株Ｔ２３。在限碳培养基中，转化子ＴＡ５的漆酶酶活为２５．３Ｕ／ｍｌ显著高于发菌株。研究发现ＴＡ５ 所产漆酶较适宜酸性条件，当ｐＨ为３．５时，漆酶活性最高。在温度为１８℃ 时，漆酶活性最高。 关键词　深绿木霉　根癌农杆菌介导（ＡＴＭＴ）　漆酶 中图分类号　Ｑ７８ 　　漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝 １　材料与方法 氧化酶，是降解木质素酶系的重要组成部分，可催化酚 类、芳胺类、羧酸类等单体的聚合反应，是一种环保型 １．１　材料、仪器设备 ［１］ ［２］ １．１．１　 菌株和质粒　深绿木霉菌 （Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ 酵素 ，木霉菌产漆酶的报道较少，Ｈｌｋｆ等 曾筛选 到一株哈茨木霉和一株深绿木霉具有分泌漆酶的能 ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）Ｔ２３，由本实验室保存；根癌农杆菌ＡＧＬ１，含 力。然而在自然环境中筛选的木霉菌产漆酶能力普遍 有质粒ｐＢＨＴ１（含有潮霉素ｈｐｈ选择标记基因）由本实 较低。利用化学和物理突变或原生质体融合技术，存 验室保存。 在突变株筛选工作量大，选择标记少、高活性菌株获得 １．１．２　引物和主要试剂　Ｔａｑ聚合酶购自ＴａＫａＲａ公 率低等问题［３］。根癌农杆菌介导的遗传转化法 司，潮霉素Ｂ，乙酰丁香酮（ＡＳ），２，２’连氮基双（３乙 （ＡＴＭＴ）长期以来主要用于植物的转基因研究，此后人 基苯并二氢噻唑啉６磺酸）二铵盐（ＡＢＴＳ）购自Ｓｉｇｍａ 们发现，农杆菌介导技术除可以对植物进行转化外还 公司，头孢霉素购自美国ＩＣＮ公司，愈创木酚培养基 ［５］ （ｍ／ｖ） ： ＣＰＤＡ培养基：马铃薯２００ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ 可以对真菌进行转化。其原理是利用根癌农杆菌Ｔｉ质 ① ｇ／Ｌ，ＫＨＰＯ３．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ １．５ｇ／Ｌ，琼脂２０ｇ／Ｌ，ｐＨ 粒上一系列Ｖｉｒ基因的表达将ＴＤＮＡ转移进真菌细胞 ２ ４ ４ 值自然。 基础培养基：葡萄糖１０ｇ／Ｌ，ＮＨＣｌ０．１ｇ／ 内，从而对真菌细胞进行转化。由于具有操作简单，转 ② ４ Ｌ，ＫＨＰＯ２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ０．５ｇ／Ｌ，ＣａＣ１０．１ｇ／Ｌ，微量元 化效率高，转化子遗传稳定等特点，已经成为了木霉分 ２ ４ ４ ２ ［４］ 素混合液７ｍｌ／Ｌ，０．１ｍｏｌ／Ｌ