实验十七 （1烟草原生质体分离和培养.pptVIP

* * 实验十七 （1）烟草原生质体分离和培养 一、原理 原生质体是无细胞壁的细胞部分。利用纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，能获得大量的原生质体。 在适宜的培养条件下，原生质体的细胞全能性表达，再生细胞壁的细胞分裂、分化和再生植株。 二、实验目的 学习植物原生质体分离和培养的方法，进一步了解植物细胞的全能性，为进行原生质体融合打下基础。 三、实验材料和用具 1、材料：烟草BY2（Bright Yellow 2）愈伤组织系 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛（?=54?m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离心管，血球记数板。 四、实验步骤 1、配制酶液（各组10ml） CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶（Cellulase Onozuka R-10） +0.5%离析酶（Macerozyme R-10）（4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中） 2～3周龄愈伤组织1g 加入到酶液中、用镊子分散愈伤组织 黑暗、 25℃酶解5~6小时，间歇轻轻摇动。 2、酶液处理BY2愈伤组织细胞 3、过滤和离心洗涤原生质体 过滤 800rpm离心3min 弃上清液 加入3ml CPW培养基，用滴管重新悬浮原生质体 800rpm离心3min （再重复上述操作2次，最后1次用D2培养基悬浮原生质体） 悬浮在1ml 原生质体培养基中 4、原生质体培养 （1）记数：取1滴原生质体于血球记数板，在显微镜下统计1个大方格（10-4ml）中的原生质体数目。 （2）调整密度：用D2培养基调整原生质体密度为1×105个原生质体/ml。 （3）植板：取0.8ml原生质体悬浮液于培养皿（?=3.5cm），形成均匀的一层薄层。Parafilm封口。 （4）培养：将培养皿置于25℃、300 lx条件下培养 。 （5）观察 培养3天后在显微镜下观察原生质体的形态变化，培养5天后观察有无原生质体再生细胞分裂。 下次实验准备： 1、配制培养基 （1）MS+0.2mg/L BA+0.02mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂，pH5.6~5.8（各组500ml） （2）YEB培养基：蛋白胨 （5g/L）+ 酵母提取物 （10g/L） + 牛肉膏（5g/L）+蔗糖（5g/L）+MgSO4（0.495g/L），pH 7.0。（各组100ml） （使用前加入50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan） （3）其他：灭菌蒸馏水，培养皿和烧杯等（同实验十六） *